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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-29
(45)【発行日】2024-09-06
(54)【発明の名称】癌を検出する方法および検出試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20240830BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240830BHJP
C07K 16/32 20060101ALN20240830BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A ZNA
C07K14/47
C07K16/32
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021516037
(86)(22)【出願日】2020-04-15
(86)【国際出願番号】 JP2020016607
(87)【国際公開番号】W WO2020218121
(87)【国際公開日】2020-10-29
【審査請求日】2023-04-14
(31)【優先権主張番号】P 2019082912
(32)【優先日】2019-04-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000173588
【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】植田 幸嗣
(72)【発明者】
【氏名】大西 なおみ
(72)【発明者】
【氏名】辻川 和丈
(72)【発明者】
【氏名】野々村 祝夫
(72)【発明者】
【氏名】植村 元秀
(72)【発明者】
【氏名】神宮司 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】大竹 則久
(72)【発明者】
【氏名】河合 康俊
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／２１７０８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１５３２４０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１４１２７３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／００７７６９５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０７９６８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００４５９１５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】JINGUSHI, Kentaro et al.，Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin，International Journal of Cancer，2018年，Vol.142，pp.607-617
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
胃癌、乳癌及び肺癌からなる群から選択される癌を検出する方法であって、血液検体において、アズロシディン（ＡＺＵ１）量を測定することを含み、
測定値があらかじめ設定された基準値を超えた場合に癌が検出されたとする、方法。
【請求項2】
大腸癌を検出する方法であって、
血液検体において、ＡＺＵ１量を測定することを含み、
測定値があらかじめ設定された基準値を超えた場合に癌が検出されたとし、
前記検体において、ＡＺＵ１が存在する細胞分泌微粒子と同一の細胞分泌微粒子上に存在する第二のマーカーを、さらに検出することを含み、
前記第二のマーカーは表２に記載されたいずれか少なくとも１つである、方法。
【表1-1】
【表1-2】
【請求項3】
ＡＺＵ１量の測定が、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いて行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記検体において、ＡＺＵ１が存在する細胞分泌微粒子と同一の細胞分泌微粒子上に存在する第二のマーカーを、さらに検出することを含み、前記第二のマーカーは表２に記載されたいずれか少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【表2-1】
【表2-2】
【請求項5】
前記第二のマーカーがＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンのうち少なくとも１つを含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項6】
第二のマーカーの検出が、第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体を用いて行われる、請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項7】
血液検体に対して使用される試薬であって、
ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を含む、胃癌、乳癌及び肺癌からなる群から選択される癌の検出に使用するための試薬。
【請求項8】
表２に記載されたいずれかの第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体をさらに含む、請求項７に記載の試薬。【表3-1】
【表3-2】
【請求項9】
血液検体に対して使用される試薬であって、
ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体と、
表２に記載されたいずれかの第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体とを含む、大腸癌の検出に使用するための試薬。
【表4-1】
【表4-2】
【請求項10】
前記第二のマーカーが、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンの少なくとも１つを含む、請求項８または９に記載の試薬。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アズロシディン（以下、「ＡＺＵ１」という）を測定対象とする癌の検出方法および検出試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
癌を検出するための腫瘍マーカーとしては、一般的に表１に示すようなものが挙げられる。しかし、いずれのマーカーも癌の早期における陽性率は低く、良性腫瘍や炎症における偽陽性や悪性度の高い癌では検出できないなど課題のあるものも多い。そのため、これらの癌を高い精度で検出可能な腫瘍マーカーの発見および検査法の開発が望まれている。
【0003】
【表1】
【0004】
ところで、ＡＺＵ１は、別名ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）または３７ｋＤａカチオン性抗菌タンパク質（ＣＡＰ３７）としても知られる、非活性型セリンプロテアーゼの一つである。ＡＺＵ１はその機能として、単球に対する化学遊走作用およびグラム陰性菌に対する抗菌作用を有する。ＡＺＵ１は好中球のアズール顆粒に存在し、感染部位に遊走した好中球から放出されることによって、血管漏出および浮腫形成を誘導して炎症を促進し生体防御に寄与している（非特許文献１～５）。
【0005】
ＡＺＵ１と疾患との関連は、体液中のＡＺＵ１量を測定することによる感染症および敗血症の診断方法が既に開示されている（特許文献１～３）。さらに近年では、体液中の細胞外小胞を分離してＡＺＵ１を検出することによる腎細胞癌の診断方法が報告されている（特許文献４、非特許文献６）。
【0006】
ＡＺＵ１と癌との関連は、乳癌、前立腺癌、大腸癌においてＡＺＵ１のメッセンジャーＲＮＡ発現量が増加していることが報告されている（非特許文献６）。しかし今日まで、これらを含む腎細胞癌以外の癌において、生検よりも低侵襲的に採取可能な体液中でのＡＺＵ１の動態に関する報告はなく、体液中のＡＺＵ１が腎細胞癌以外の癌の検出に適用できるか不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特許第５１６６５２２号公報
【文献】特許第５４８８８８５号公報
【文献】特許第５８１８９１６号公報
【文献】国際公開第２０１８/０７９６８９号パンフレット
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． ２００９ Ｍａｒ；８５（３）：３４４－５１
【文献】Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００９ Ｎｏｖ；３０（１１）：５３８－４６
【文献】Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００１ Ｏｃｔ；７（１０）：１１２３－７．
【文献】Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００９ Ｎｏｖ；３０（１１）：５４７－５６
【文献】Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００９ Ａｕｇ；１０２（２）：１９８－２０５
【文献】Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１８ Ｆｅｂ １；１４２（３）：６０７－６１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、癌を簡便かつ高い精度で検出する方法、および前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意検討した結果、体液中のＡＺＵ１が健常者と比較して癌患者で有意に高値を示すという知見を得て、ＡＺＵ１が癌の検出マーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成させた。
【0011】
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出する方法であって、検体において、アズロシディン（ＡＺＵ１）量を測定することを含み、測定値があらかじめ設定された基準値を超えた場合に癌が検出されたとする、方法。
［２］前記癌が、胃癌、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］ＡＺＵ１量の測定が、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いて行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記検体において、ＡＺＵ１が存在する細胞分泌微粒子と同一の細胞分泌微粒子上に存在する第二のマーカーを、さらに検出することを含み、前記第二のマーカーは表２に記載されたいずれか少なくとも１つである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記第二のマーカーがＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンのうち少なくとも１つを含む、［４］に記載の方法。
［６］第二のマーカーの検出が、第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体を用いて行われる、［４］または［５］に記載の方法。
［７］ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を含む、癌（ただし腎細胞癌を除く）の検出に使用するための試薬。
［８］前記癌が、胃癌、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群から選択される、［７］に記載の試薬。
［９］表２に記載されたいずれかの第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体をさらに含む、［７］又は［８］に記載の試薬。
［１０］前記第二のマーカーが、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンの少なくとも１つを含む、［９］に記載の試薬。
［１］癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出する方法であって、検体において、アズロシディン（ＡＺＵ１）量を測定することを含み、測定値があらかじめ設定された基準値を超えた場合に癌が検出されたとする、方法。
［２］前記癌が、胃癌、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］ＡＺＵ１量の測定が、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いて行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記検体において、ＡＺＵ１が存在する細胞分泌微粒子と同一の細胞分泌微粒子上に存在する第二のマーカーを、さらに検出することを含み、前記第二のマーカーは表２に記載されたいずれか少なくとも１つである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記第二のマーカーがＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンのうち少なくとも１つを含む、［４］に記載の方法。
［６］第二のマーカーの検出が、第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体を用いて行われる、［４］または［５］に記載の方法。
［７］ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を含む、癌（ただし腎細胞癌を除く）の検出に使用するための試薬。
［８］前記癌が、胃癌、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群から選択される、［７］に記載の試薬。
［９］表２に記載されたいずれかの第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体をさらに含む、［７］又は［８］に記載の試薬。
［１０］前記第二のマーカーが、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンの少なくとも１つを含む、［９］に記載の試薬。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、癌を簡便かつ高い精度で検出する方法、および前記方法に利用できる試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】実施例８において、ＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１恒常発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いたＣＥＬＩＳＡによる、ハイブリドーマ細胞培養上清のスクリーニング結果を示す図。
【図2】実施例９において、分泌型ＡＺＵ１を用いたＥＬＩＳＡによる、ハイブリドーマ細胞培養上清のスクリーニング結果を示す図。
【図3】実施例１３において、細胞分泌微粒子を用いたＥＬＩＳＡによる、抗ＡＺＵ１モノクローナル抗体の固相抗体としての性能評価結果を示す図。
【図4】実施例１３において、細胞分泌微粒子を用いたＥＬＩＳＡによる、抗ＡＺＵ１モノクローナル抗体のビオチン標識抗体としての性能評価結果を示す図。
【図5】実施例１４において、ＥＬＩＳＡの固相抗体として抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体のいずれを用いても、ＡＺＵ１を含む細胞分泌微粒子を検出可能であることを示す図。
【図6】実施例１５－１において、健常者群と胃癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ８１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図7】実施例１５－２において、健常者群と胃癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ９抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図8】実施例１５－３において、健常者群と胃癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ６３抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図9】実施例１５－４において、健常者群と胃癌患者群における、固相抗体として抗ＡＺＵ１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＣＤ８１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図10】実施例１５－５において、健常者群と胃癌患者群における、固相抗体として抗ＡＺＵ１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＣＤ９抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図11】実施例１５－６において、健常者群と胃癌患者群における、固相抗体として抗ＡＺＵ１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＣＤ６３抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図12】実施例１６において、健常者群と胃癌患者群における、固相受容体としてＴｉｍ４－ｈＦｃ、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図13】比較例１において、健常者群と胃癌患者群における、ＣＥＡ測定値のボックスプロットを示す図。
【図14】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、固相抗体として抗ＣＤ８１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を示す図。
【図15】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、固相抗体として抗ＣＤ９抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のＲＯＣ曲線解析の結果を示す図。
【図16】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、固相抗体として抗ＣＤ６３抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のＲＯＣ曲線解析の結果を示す図。
【図17】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、固相抗体として抗ＡＺＵ１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＣＤ８１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のＲＯＣ曲線解析の結果を示す図。
【図18】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、固相抗体として抗ＡＺＵ１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＣＤ９抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のＲＯＣ曲線解析の結果を示す図。
【図19】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、固相抗体として抗ＡＺＵ１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＣＤ６３抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のＲＯＣ曲線解析の結果を示す図。
【図20】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、固相受容体としてＴｉｍ４－ｈＦｃ、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のＲＯＣ曲線解析の結果を示す図。
【図21】実施例１７において、健常者群および胃癌患者群間における、ＣＥＡ測定値のＲＯＣ曲線解析の結果を示す図。
【図22】実施例１８－１において、健常者群と乳癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ８１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図23】実施例１８－２において、健常者群と乳癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ９抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図24】実施例１８－３において、健常者群と乳癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ６３抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図25】実施例１９－１において、健常者群と大腸癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ８１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図26】実施例１９－２において、健常者群と大腸癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ９抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図27】実施例１９－３において、健常者群と大腸癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ６３抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図28】実施例２０－１において、健常者群と肺癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ８１抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図29】実施例２０－２において、健常者群と肺癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ９抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図30】実施例２０－３において、健常者群と肺癌患者群における、固相抗体として抗ＣＤ６３抗体、ビオチン標識抗体として抗ＡＺＵ１抗体を用いたＥＬＩＳＡ吸光度のボックスプロットを示す図。
【図31】実施例２１において、健常者、肺癌、大腸癌、乳癌、および胃癌の各群における、血清検体に含まれる遊離ＡＺＵ１濃度のボックスプロットを示す図。
【発明を実施するための形態】
【0014】
［１］本発明の癌を検出する方法
本発明の第一の態様は、癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出する方法であり、検体においてＡＺＵ１量を測定することを含む。これは、健常な検体と比べて、癌の血液等の生体試料中に特徴的にＡＺＵ１が存在することに基づく方法である。検体におけるＡＺＵ１量の測定は、通常インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。
本発明の方法により、後述する実施例が示す通り、従来知られたＣＥＡなどの腫瘍マーカーを測定した場合に比べて、癌を高い感度と特異度で検出することができる。
本発明の第一の態様は、癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出する方法であり、検体においてＡＺＵ１量を測定することを含む。これは、健常な検体と比べて、癌の血液等の生体試料中に特徴的にＡＺＵ１が存在することに基づく方法である。検体におけるＡＺＵ１量の測定は、通常インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。
本発明の方法により、後述する実施例が示す通り、従来知られたＣＥＡなどの腫瘍マーカーを測定した場合に比べて、癌を高い感度と特異度で検出することができる。
【0015】
なお、本発明の方法は、癌を検出する段階までを含むものであり、癌の診断に関する最終的な判断行為は含まれない。医師は、本発明の方法による検出結果等を参照して、癌を診断したり治療方針を立てたりする。
通常、癌を検出する対象（被検動物）は、ヒトである。
通常、癌を検出する対象（被検動物）は、ヒトである。
【0016】
本発明において測定の対象となる検体としては、例として血液、尿、唾液、涙液、腹水、腹腔洗浄液、脳脊髄液、および細胞もしくは組織の抽出液等が挙げられる。検体採取の容易性を考慮すると、血液、尿、唾液および涙液が好ましい。他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液がより好ましい。血液は、全血のまま用いても、血清、血漿、血球などの血液成分に分離して用いてもよいが、血清または血漿を用いることが好ましい。検体の希釈倍率は特に制限されないが、例えば無希釈から１００倍希釈の範囲で、使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよい。
なお、検体は通常、後述する細胞から分泌される微粒子（細胞分泌微粒子）を含む。
なお、検体は通常、後述する細胞から分泌される微粒子（細胞分泌微粒子）を含む。
【0017】
本発明が対象とする疾患は、癌（ただし腎細胞癌を除く）である。好ましくは胃癌、乳癌、大腸癌、および／または肺癌であり、より好ましくは胃癌である。
【0018】
本発明において測定対象であるＡＺＵ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢのアクセッション番号Ｐ２０１６０において開示されているヒトＡＺＵ１タンパク質のアミノ酸配列のうち、２７残基目のイソロイシンから２４８残基目のプロリンまでの配列を少なくとも含むペプチド、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。前記同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。また、このペプチドは、前記配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸からなるペプチドであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～５個をいう。また、前記配列の片側又は両側に他のペプチドフラグメントを有していてもよい。
【0019】
本発明において測定されるＡＺＵ１は、可溶性タンパク質として存在するものを測定してもよく、細胞から分泌される微粒子上に存在するものを測定してもよく、又はそれら両方を測定してもよい。微粒子上に存在するＡＺＵ１を測定する場合は、当該微粒子上に第二のマーカーと共存しているものを測定してもよい。
細胞から分泌される微粒子の例として、エクソソームが挙げられる。エクソソームとは、脂質二重膜で構成された、通常５０～２００ｎｍの直径を有する膜小胞である。エクソソームは、テトラスパニン類やインテグリン類などの膜タンパク質、多胞体形成に関連するタンパク質、熱ショックタンパク質などを多く含むことが知られている。またエクソソームを構成する脂質二重膜は、その膜表面にホスファチジルセリンを有することが知られている。エクソソームに多く含まれる代表的な分子を表２に示す。
細胞から分泌される微粒子の例として、エクソソームが挙げられる。エクソソームとは、脂質二重膜で構成された、通常５０～２００ｎｍの直径を有する膜小胞である。エクソソームは、テトラスパニン類やインテグリン類などの膜タンパク質、多胞体形成に関連するタンパク質、熱ショックタンパク質などを多く含むことが知られている。またエクソソームを構成する脂質二重膜は、その膜表面にホスファチジルセリンを有することが知られている。エクソソームに多く含まれる代表的な分子を表２に示す。
【0020】
本発明における第二のマーカーとは、細胞分泌微粒子上に存在する分子であれば特に制限されないが、好ましくは前述した表２に示すタンパク質およびホスファチジルセリンからなる群に含まれる少なくとも１つを指し、より好ましくはＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンの少なくとも１つを含む。なお、表２に示すタンパク質には、それと高い相同性（８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するアミノ酸配列を含むペプチドも含まれるものとする。
第二のマーカーは２種以上であってもよいため、「第二の」という語は「ＡＺＵ１の他の」という意味で理解されてよい。
本発明において検出される第二のマーカーは、細胞分泌微粒子上に存在する分子であれば特に制限されないが、好ましくは表２に示すタンパク質およびホスファチジルセリンであって、ＡＺＵ１が存在する細胞分泌微粒子と同一の細胞分泌微粒子上に存在するものである。
第二のマーカーは２種以上であってもよいため、「第二の」という語は「ＡＺＵ１の他の」という意味で理解されてよい。
本発明において検出される第二のマーカーは、細胞分泌微粒子上に存在する分子であれば特に制限されないが、好ましくは表２に示すタンパク質およびホスファチジルセリンであって、ＡＺＵ１が存在する細胞分泌微粒子と同一の細胞分泌微粒子上に存在するものである。
【0021】
【表2-1】
【0022】
【表2-2】
【0023】
本発明の検出方法において、ＡＺＵ１量を測定する方法、および細胞分泌微粒子上に共存する第二のマーカーのうち少なくとも１つとＡＺＵ１とを測定（検出）する方法は、ＡＺＵ１量の測定が妨げられない限りにおいて特に制限されない。例えば、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法や、質量分析法を利用した方法が挙げられる。
ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法の具体例としては、以下のものが挙げられる。
ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法の具体例としては、以下のものが挙げられる。
【0024】
［ａ］ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体および標識したＡＺＵ１を用い、標識したＡＺＵ１および検体に含まれるＡＺＵ１が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
［ｂ］ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体とＡＺＵ１との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
［ｃ］蛍光標識した、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用い、当該抗体とＡＺＵ１とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
［ｂ］ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体とＡＺＵ１との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
［ｃ］蛍光標識した、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用い、当該抗体とＡＺＵ１とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
【0025】
［ｄ］ＡＺＵ１を特異的に認識する２つの抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体とＡＺＵ１との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。このとき当該２つの抗体は、エピトープの異なる２種類の抗体であることが好ましい。
［ｅ］前処理として、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体により検体中のＡＺＵ１を濃縮後、ＡＺＵ１と抗体との結合物を質量分析装置により検出する方法。
［ｆ］蛍光標識した、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用い、当該抗体をＡＺＵ１に結合させた後に流路内で測定対象を整列させ、個々の粒子に励起光を照射したときに得られる散乱光と蛍光をもとに当該抗体と測定対象が結合した複合体を計数するフローサイトメトリー法。
［ｅ］前処理として、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体により検体中のＡＺＵ１を濃縮後、ＡＺＵ１と抗体との結合物を質量分析装置により検出する方法。
［ｆ］蛍光標識した、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用い、当該抗体をＡＺＵ１に結合させた後に流路内で測定対象を整列させ、個々の粒子に励起光を照射したときに得られる散乱光と蛍光をもとに当該抗体と測定対象が結合した複合体を計数するフローサイトメトリー法。
【0026】
これらのうち［ｄ］および［ｅ］の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では［ｄ］の方法が試薬および装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
【0027】
ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体は特に制限されないが、ＡＺＵ１タンパク質そのもの、ＡＺＵ１の部分領域からなるオリゴペプチド、ＡＺＵ１の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。
【0028】
なお、免疫原として、ＡＺＵ１タンパク質そのもの、またはＡＺＵ１の部分領域からなるオリゴペプチドを用いると、前記タンパク質または前記オリゴペプチドを調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の抗原に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、結果として検体に含まれるＡＺＵ１を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、ＡＺＵ１の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いると、免疫された動物の体内でＡＺＵ１が構造変化を受けずに発現されるため、所望の抗原に対して高い特異性および結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるため好ましい。
【0029】
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
【0030】
ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
【0031】
ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行い、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングを行うことで、ＡＺＵ１を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
【0032】
本発明で用いるＡＺＵ１を特異的に認識する抗体の選定は、宿主発現系に由来する、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型ＡＺＵ１に対する親和性に基づいて行えばよい。
【0033】
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＡＺＵ１に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎由来２９３Ｔ細胞株、サル腎由来ＣＯＳ－７細胞株、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ－Ｋ１細胞株またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
【0034】
本発明の癌検出方法で用いる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で確立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿により抗体濃縮後、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはプロテインＡ、プロテインＧ、もしくはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって抗体の精製が可能である。
【0035】
本発明において、同一の細胞分泌微粒子上に存在するＡＺＵ１量の測定と第二のマーカーの検出とをともに行う場合には、ＡＺＵ１を認識する抗体に加えて、第二のマーカーを特異的に認識する抗体又は受容体（以降「抗体等」とも記す）をさらに用いることが好ましい。
【0036】
本発明において第二のマーカーとしては、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンの少なくとも１つを含むことが好ましく、それらを特異的に認識する抗体又は受容体としては、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体またはホスファチジルセリン受容体であることが好ましい。
【0037】
本発明において使用する抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ９抗体は、前述のＡＺＵ１を認識する抗体と同様の方法によって得ることができる。
【0038】
本発明において使用するホスファチジルセリン受容体は特に制限されないが、例えばＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ３、Ｔｉｍ４が挙げられ、ホスファチジルセリンに対して高い特異性と結合力を有するＴｉｍ４（国際公開第２０１６／０８８６８９号）が好ましい。Ｔｉｍ４は、少なくともホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列を有しているものであればよく、例えばＴｉｍ４タンパク質そのもの、Ｔｉｍ４のＩｇＶドメインを含む部分領域からなるペプチド、Ｔｉｍ４のＩｇＶドメインを含む部分領域に他のペプチドフラグメントを結合した融合タンパク質を用いることができる。
【0039】
なお、前述したサンドイッチ法で結合定量法を行う際に用いる標識した抗体等は、ペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープまたは機能性微粒子といった検出装置で検出可能な物質、もしくはビオチンに対するアビジンのように特異的に結合する相手が存在する物質等で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行えばよい。
【0040】
本発明の方法において、質量分析法を利用してＡＺＵ１を検出し定量測定する方法について、以下に具体的に説明する。
検体が血液である場合は、前処理工程として、血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等のタンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲルろ過または逆相クロマトグラフィー等でさらに分画することが好ましい。
検体が血液である場合は、前処理工程として、血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等のタンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲルろ過または逆相クロマトグラフィー等でさらに分画することが好ましい。
【0041】
測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザー脱離イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＭＳ）等により行うことができる。
【0042】
本発明の検出方法では、測定により得たＡＺＵ１量が、対照から算出した基準値（カットオフ値）を超えた場合に、癌が検出されたと判定することが好ましい。
判定に用いるＡＺＵ１量は、測定値または換算濃度値の何れでもよい。なお、換算濃度値は、ＡＺＵ１を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。標準試料の濃度決定は、質量分析を用いた標準ペプチドの検量線に基づいて測定値から換算される値としてもよい。
カットオフ値は、健常人と癌患者とから採取した検体をそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。
判定に用いるＡＺＵ１量は、測定値または換算濃度値の何れでもよい。なお、換算濃度値は、ＡＺＵ１を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。標準試料の濃度決定は、質量分析を用いた標準ペプチドの検量線に基づいて測定値から換算される値としてもよい。
カットオフ値は、健常人と癌患者とから採取した検体をそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。
【0043】
本発明の癌を検出する方法は、癌を治療する方法に適用することができる。すなわち、本発明により、患者における癌（ただし腎細胞癌を除く）を治療する方法であって、
（ｉ）ＡＺＵ１量の測定値があらかじめ設定した基準値を超えるものとして患者を同定する工程、及び
（ｉｉ）前記同定された患者に対して治療を施す工程、を含む方法が提供される。
前記工程（ｉ）の同定において、ＡＺＵ１量の測定は、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いて行われてもよいし、質量分析法を用いて行われてもよい。
前記工程（ｉｉ）の治療としては、外科的切除、薬物療法、放射線療法等が挙げられるが特に限定されない。
（ｉ）ＡＺＵ１量の測定値があらかじめ設定した基準値を超えるものとして患者を同定する工程、及び
（ｉｉ）前記同定された患者に対して治療を施す工程、を含む方法が提供される。
前記工程（ｉ）の同定において、ＡＺＵ１量の測定は、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を用いて行われてもよいし、質量分析法を用いて行われてもよい。
前記工程（ｉｉ）の治療としては、外科的切除、薬物療法、放射線療法等が挙げられるが特に限定されない。
【0044】
［２］本発明の癌を検出する試薬
本発明の第二の態様は、癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出するための試薬であり、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を含んでいる。
本発明の第二の態様は、癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出するための試薬であり、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体を含んでいる。
【0045】
本発明の試薬は、さらに、表２に示す第二のマーカーを特異的に認識する抗体又は受容体をさらに含んでいることが好ましい。第二のマーカーを特異的に認識する抗体又は受容体（抗体等）は特に制限されないが、例えばＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９およびホスファチジルセリンの少なくとも１つを特異的に認識する抗体又は受容体であることが好ましく、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体またはホスファチジルセリン受容体のいずれかであることがより好ましい。ホスファチジルセリン受容体は特に制限されないが、例えばＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ３、Ｔｉｍ４が挙げられ、ホスファチジルセリンに対して高い特異性と結合力を有するＴｉｍ４が好ましい。Ｔｉｍ４は、少なくともホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列を有しているものであればよく、例えばＴｉｍ４タンパク質そのもの、Ｔｉｍ４のＩｇＶドメインを含む部分領域からなるペプチド、Ｔｉｍ４のＩｇＶドメインを含む部分領域に他のペプチドフラグメントを結合した融合タンパク質を用いることができる。
【0046】
本発明の試薬および測定方法を、前述したサンドイッチ法の３つの方式について以下に具体的に説明する。ただし、本発明の試薬および測定方法は、これら３つの方式に限定されるものではない。
【0047】
［方式１］２ステップサンドイッチ法
本方式で用いる試薬は、２種類の抗体等（以下、「抗体等１」および「抗体等２」とする）を含む。抗体等１と抗体等２は、測定対象物質に対する結合部位が互いに異なることが好ましい。抗体等１および抗体等２の組み合わせは、例えば下記［ａ］～［ｃ］の３通りが挙げられる。
［ａ］抗体等１：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体、抗体等２：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体であって抗体等１とは同一または別の抗体
［ｂ］抗体等１：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体、抗体等２：第二のマーカーを特異的に認識する抗体又は受容体
［ｃ］抗体等１：第二のマーカーを特異的に認識する抗体又は受容体、抗体等２：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体
本方式で用いる試薬は、２種類の抗体等（以下、「抗体等１」および「抗体等２」とする）を含む。抗体等１と抗体等２は、測定対象物質に対する結合部位が互いに異なることが好ましい。抗体等１および抗体等２の組み合わせは、例えば下記［ａ］～［ｃ］の３通りが挙げられる。
［ａ］抗体等１：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体、抗体等２：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体であって抗体等１とは同一または別の抗体
［ｂ］抗体等１：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体、抗体等２：第二のマーカーを特異的に認識する抗体又は受容体
［ｃ］抗体等１：第二のマーカーを特異的に認識する抗体又は受容体、抗体等２：ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体
【0048】
本方式の試薬は、以下の［１］～［３］に示す方法で作製することができる。
［１］まず、抗体等１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
［２］担体に前記抗体等１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面をウシ血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行い１次試薬とする。
［３］他方の抗体等２を標識し、得られた標識抗体等を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体等２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープまたは機能性微粒子といった検出装置で検出可能な物質、もしくはビオチンに対するアビジンのように特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。
このようにして作製した本方式の試薬は、必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
［１］まず、抗体等１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
［２］担体に前記抗体等１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面をウシ血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行い１次試薬とする。
［３］他方の抗体等２を標識し、得られた標識抗体等を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体等２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープまたは機能性微粒子といった検出装置で検出可能な物質、もしくはビオチンに対するアビジンのように特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。
このようにして作製した本方式の試薬は、必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
【0049】
次に、本方式で作製した試薬を用いてＡＺＵ１を検出し測定するには、以下の［４］～［６］に示す方法で行えばよい。
［４］前述した［２］で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［５］未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて［３］で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［６］未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体等の標識物質を定量し、既知濃度のＡＺＵ１を標準として作成した検量線により、検体中のＡＺＵ１濃度を定量する。
［４］前述した［２］で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［５］未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて［３］で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［６］未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体等の標識物質を定量し、既知濃度のＡＺＵ１を標準として作成した検量線により、検体中のＡＺＵ１濃度を定量する。
【0050】
［方式２］１ステップサンドイッチ法
本方式で用いる試薬は、前述の方式１と同様に抗体等１および抗体等２を含む。
本方式で用いる試薬は、前述の方式１と同様に抗体等１および抗体等２を含む。
【0051】
本方式の試薬を作製するには、方式１の［１］～［２］に示した方法で担体に抗体等１を結合させブロッキング処理を行ったものを作製し、前記抗体等固定化担体に、標識した抗体等２を含む緩衝液をさらに添加すればよい。
このようにして作製した本方式の試薬は、必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
このようにして作製した本方式の試薬は、必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
【0052】
次に、本方式で作製した試薬を用いてＡＺＵ１を検出し測定するには、以下の［７］～［８］に示す方法で行えばよい。
［７］前述した方法で作製した試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［８］未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体等の標識物質を定量し、既知濃度のＡＺＵ１を標準として作成した検量線により、検体中のＡＺＵ１濃度を定量する。
［７］前述した方法で作製した試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［８］未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体等の標識物質を定量し、既知濃度のＡＺＵ１を標準として作成した検量線により、検体中のＡＺＵ１濃度を定量する。
【0053】
［方式３］ホモジニアスサンドイッチ法
本方式で用いる試薬は、前述の方式１および２と同様に抗体等１および抗体等２を含み、ストレプトアビジンで被覆された、励起光により励起される標識物質をさらに含む。前記のストレプトアビジン被覆標識物質としては、例えばＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を好適に使用できる。
本方式で用いる試薬は、前述の方式１および２と同様に抗体等１および抗体等２を含み、ストレプトアビジンで被覆された、励起光により励起される標識物質をさらに含む。前記のストレプトアビジン被覆標識物質としては、例えばＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を好適に使用できる。
【0054】
本方式の試薬は、以下の［９］～［１０］に示す方法で作製することができる。
［９］まず、抗体等１をビオチンで標識する。前記ビオチン標識は、従来公知の方法により行えばよく、例えばＢｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２標識キット（同仁化学研究所製）を用いた方法が挙げられる。
［１０］他方の抗体等２を、一重項酸素によりシグナルを発する物質で標識する。この一重項酸素は、前記ストレプトアビジン被覆標識物質を励起した時に発生するものである。前記シグナルは蛍光シグナルが好ましい。前記シグナル発生物質としては、例えばＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を好適に使用できる。抗体等２とシグナル発生物質の結合方法は特に制限されず、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを利用した、シグナル発生物質表面のアルデヒド基に対する還元的アミノ化架橋が挙げられる。
［９］まず、抗体等１をビオチンで標識する。前記ビオチン標識は、従来公知の方法により行えばよく、例えばＢｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２標識キット（同仁化学研究所製）を用いた方法が挙げられる。
［１０］他方の抗体等２を、一重項酸素によりシグナルを発する物質で標識する。この一重項酸素は、前記ストレプトアビジン被覆標識物質を励起した時に発生するものである。前記シグナルは蛍光シグナルが好ましい。前記シグナル発生物質としては、例えばＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を好適に使用できる。抗体等２とシグナル発生物質の結合方法は特に制限されず、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを利用した、シグナル発生物質表面のアルデヒド基に対する還元的アミノ化架橋が挙げられる。
【0055】
次に、本方式で作製した試薬を用いてＡＺＵ１を検出し測定するには、以下の［１１］～［１３］に示す方法で行えばよい。
［１１］前述した［９］で作製したビオチン標識抗体等１、［１０］で作製したシグナル発生物質標識抗体等２、および検体を、一定時間、一定温度、遮光条件下のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［１２］続いてストレプトアビジン被覆標識物質を添加して一定時間、一定温度、遮光条件下のもと接触させ、ビオチン標識抗体とストレプトアビジン被覆標識物質とを結合させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［１３］分析装置を用いて、励起光を照射したときにシグナル発生物質標識抗体等２から発せられるシグナルを定量し、既知濃度のＡＺＵ１を標準として作成した検量線により、検体中のＡＺＵ１濃度を定量する。分析装置としては、例えばＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を好適に使用できる。
［１１］前述した［９］で作製したビオチン標識抗体等１、［１０］で作製したシグナル発生物質標識抗体等２、および検体を、一定時間、一定温度、遮光条件下のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［１２］続いてストレプトアビジン被覆標識物質を添加して一定時間、一定温度、遮光条件下のもと接触させ、ビオチン標識抗体とストレプトアビジン被覆標識物質とを結合させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分間から１８０分間反応させればよい。
［１３］分析装置を用いて、励起光を照射したときにシグナル発生物質標識抗体等２から発せられるシグナルを定量し、既知濃度のＡＺＵ１を標準として作成した検量線により、検体中のＡＺＵ１濃度を定量する。分析装置としては、例えばＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を好適に使用できる。
【0056】
本発明の試薬に含まれる試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、測定の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。例えば、検体として血清や血漿を２０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＡＺＵ１量の測定を行う場合、当該検体２０μＬを抗体等と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体等１の量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識した抗体等２の量が２ｎｇから２０μｇであってよい。
【0057】
本発明の試薬は、用手法での測定にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた測定にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた測定は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく測定が可能で、かつ短時間に検体中のＡＺＵ１が定量可能であるため、好ましい。
【0058】
本発明第二の態様の別の側面は、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体の、癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出するための試薬の製造における使用である。また、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体、及び表２に記載されたいずれかの第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体の、癌（ただし腎細胞癌を除く）を検出するための試薬の製造における使用である。
また、本発明の別の側面は、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体の、癌（ただし腎細胞癌を除く）の検出における使用である。また、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体、及び表２に記載されたいずれかの第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体の、癌（ただし腎細胞癌を除く）の検出における使用である。
また、本発明の別の側面は、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体の、癌（ただし腎細胞癌を除く）の検出における使用である。また、ＡＺＵ１を特異的に認識する抗体、及び表２に記載されたいずれかの第二のマーカーを特異的に認識する抗体または受容体の、癌（ただし腎細胞癌を除く）の検出における使用である。
【実施例】
【0059】
以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0060】
［実施例１］ＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１発現プラスミドの作製
ヒトＡＺＵ１タンパク質のアミノ酸配列のうち２７残基目のイソロイシンから２４８残基目のプロリンまでの配列をコードする領域をＰＣＲ法により増幅した。アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）からなるＦＬＡＧタグペプチドのコード領域と、胎盤型アルカリ性ホスファターゼに由来するＧＰＩアンカーのシグナルペプチドのコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）に、前記のＰＣＲ増幅産物をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて挿入し、Ｎ末端側にはＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にはＧＰＩアンカーのシグナルペプチドがそれぞれ付加されたＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１を発現可能なプラスミドを作製した。
ヒトＡＺＵ１タンパク質のアミノ酸配列のうち２７残基目のイソロイシンから２４８残基目のプロリンまでの配列をコードする領域をＰＣＲ法により増幅した。アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）からなるＦＬＡＧタグペプチドのコード領域と、胎盤型アルカリ性ホスファターゼに由来するＧＰＩアンカーのシグナルペプチドのコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）に、前記のＰＣＲ増幅産物をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて挿入し、Ｎ末端側にはＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にはＧＰＩアンカーのシグナルペプチドがそれぞれ付加されたＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１を発現可能なプラスミドを作製した。
【0061】
［実施例２］分泌型ＡＺＵ１発現プラスミドの作製
ＦＬＡＧタグペプチドのコード領域と、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸配列ＣＫＶＬＲＲＨ（配列番号２）からなるＢＮＣペプチド（特開２００９－２４０３００号）のコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）に、実施例１で作製したＡＺＵ１コード領域のＰＣＲ増幅産物をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて挿入し、Ｎ末端側にはＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にはＢＮＣペプチドがそれぞれ付加された分泌型ＡＺＵ１を発現可能なプラスミドを作製した。
ＦＬＡＧタグペプチドのコード領域と、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸配列ＣＫＶＬＲＲＨ（配列番号２）からなるＢＮＣペプチド（特開２００９－２４０３００号）のコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）に、実施例１で作製したＡＺＵ１コード領域のＰＣＲ増幅産物をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて挿入し、Ｎ末端側にはＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にはＢＮＣペプチドがそれぞれ付加された分泌型ＡＺＵ１を発現可能なプラスミドを作製した。
【0062】
［実施例３］ＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１恒常発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞の作製
実施例１で作製したＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１発現プラスミドを、常法に従ってチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ－Ｋ１細胞株に遺伝子導入後、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて５％ＣＯ2インキュベータにて３７℃で２４時間培養した。培養後、抗生物質Ｇ４１８溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を２５０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに３週間培養した。抗ＦＬＡＧ抗体を用いてセルソーターによりＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１を恒常的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を獲得した。
実施例１で作製したＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１発現プラスミドを、常法に従ってチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ－Ｋ１細胞株に遺伝子導入後、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて５％ＣＯ2インキュベータにて３７℃で２４時間培養した。培養後、抗生物質Ｇ４１８溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を２５０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに３週間培養した。抗ＦＬＡＧ抗体を用いてセルソーターによりＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１を恒常的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を獲得した。
【0063】
［実施例４］分泌型ＡＺＵ１一過性発現２９３Ｔ細胞の作製
実施例２で作製した分泌型ＡＺＵ１発現プラスミドを、常法に従ってヒト胎児腎由来２９３Ｔ細胞株に遺伝子導入後、１０％ＦＢＳ添加Ｄ－ＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて５％ＣＯ2インキュベータにて３７℃で培養し、ＡＺＵ１を一過性発現させた。
実施例２で作製した分泌型ＡＺＵ１発現プラスミドを、常法に従ってヒト胎児腎由来２９３Ｔ細胞株に遺伝子導入後、１０％ＦＢＳ添加Ｄ－ＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて５％ＣＯ2インキュベータにて３７℃で培養し、ＡＺＵ１を一過性発現させた。
【0064】
［実施例５］分泌型ＡＺＵ１溶液の回収
実施例４で作製した分泌型ＡＺＵ１一過性発現２９３Ｔ細胞を７２時間培養した後に、培養液を遠心分離し、上清を分泌型ＡＺＵ１溶液として回収した。
実施例４で作製した分泌型ＡＺＵ１一過性発現２９３Ｔ細胞を７２時間培養した後に、培養液を遠心分離し、上清を分泌型ＡＺＵ１溶液として回収した。
【0065】
［実施例６］超遠心法による細胞分泌微粒子の回収
２９３Ｔ細胞株、実施例４で作製した分泌型ＡＺＵ１一過性発現２９３Ｔ細胞、ヒト腎癌由来ＡＣＨＮ細胞株、ならびにＡＺＵ１－ＦＬＡＧ発現ＡＣＨＮ細胞（特許文献４および非特許文献６）を、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５、１００ ＫＤａ ｃｕｔｏｆｆ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）で限外ろ過したＦＢＳを１０％添加したＤ－ＭＥＭ培地を用いて５％ＣＯ2インキュベータにて３７℃で４８時間培養した後に、以下の方法で細胞分泌微粒子を回収した。
２９３Ｔ細胞株、実施例４で作製した分泌型ＡＺＵ１一過性発現２９３Ｔ細胞、ヒト腎癌由来ＡＣＨＮ細胞株、ならびにＡＺＵ１－ＦＬＡＧ発現ＡＣＨＮ細胞（特許文献４および非特許文献６）を、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５、１００ ＫＤａ ｃｕｔｏｆｆ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）で限外ろ過したＦＢＳを１０％添加したＤ－ＭＥＭ培地を用いて５％ＣＯ2インキュベータにて３７℃で４８時間培養した後に、以下の方法で細胞分泌微粒子を回収した。
【0066】
［１］培養液６０ｍＬを、４℃、２０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。
［２］上記の遠心上清を、４℃、１６０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。
［３］上記の遠心上清を、４℃、１０００００×ｇで１６時間超遠心を行い、上清を除去して沈殿を回収した。
［４］上記の超遠心沈殿にＰＢＳを加え、４℃、１０００００×ｇで１６時間超遠心を行い、上清を除去して沈殿を回収した。
［５］上記の超遠心沈殿にＰＢＳを２００μＬ添加し、ピペッティングにより懸濁し、細胞分泌微粒子を回収した。
［２］上記の遠心上清を、４℃、１６０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。
［３］上記の遠心上清を、４℃、１０００００×ｇで１６時間超遠心を行い、上清を除去して沈殿を回収した。
［４］上記の超遠心沈殿にＰＢＳを加え、４℃、１０００００×ｇで１６時間超遠心を行い、上清を除去して沈殿を回収した。
［５］上記の超遠心沈殿にＰＢＳを２００μＬ添加し、ピペッティングにより懸濁し、細胞分泌微粒子を回収した。
【0067】
［実施例７］免疫および細胞融合
４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに対して、実施例１で構築したＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１発現プラスミド４０μｇ／匹の投与を７日ごとに計６回行った後、脾臓細胞を採取した。常法に従い、回収した脾臓細胞とマウスミエローマＳｐ２／０細胞株をポリエチレングリコール存在下で融合し、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加したＧＩＴ培地（富士フイルム和光純薬製）で約１０日間培養することによりハイブリドーマ細胞を選択した。
４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに対して、実施例１で構築したＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１発現プラスミド４０μｇ／匹の投与を７日ごとに計６回行った後、脾臓細胞を採取した。常法に従い、回収した脾臓細胞とマウスミエローマＳｐ２／０細胞株をポリエチレングリコール存在下で融合し、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加したＧＩＴ培地（富士フイルム和光純薬製）で約１０日間培養することによりハイブリドーマ細胞を選択した。
【0068】
［実施例８］抗ＡＺＵ１抗体産生細胞のスクリーニング（１）
抗ＡＺＵ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、実施例３で作製したＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１恒常発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いて、以下に示す細胞酵素免疫測定法（ＣＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした。
抗ＡＺＵ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、実施例３で作製したＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１恒常発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いて、以下に示す細胞酵素免疫測定法（ＣＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした。
【0069】
［１］９６ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ製）に、ＧＰＩアンカー型ＡＺＵ１恒常発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を５×１０4個／ウェル添加し、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて５％ＣＯ2インキュベータにて３７℃で２４時間培養した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したマウスＩｇＧ（陰性対照、ＮＣ）および市販のマウス抗ＡＺＵ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）（陽性対照、ＰＣ）ならびに無希釈のハイブリドーマ細胞培養上清を、５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ－Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したマウスＩｇＧ（陰性対照、ＮＣ）および市販のマウス抗ＡＺＵ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）（陽性対照、ＰＣ）ならびに無希釈のハイブリドーマ細胞培養上清を、５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ－Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
【0070】
［４］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
［５］１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［６］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
測定結果を図１に示す。６つのハイブリドーマ細胞培養上清（１－２、１－７、１－８、１－１３、１－１４および１－１５）から高いシグナルが検出された。
［５］１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［６］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
測定結果を図１に示す。６つのハイブリドーマ細胞培養上清（１－２、１－７、１－８、１－１３、１－１４および１－１５）から高いシグナルが検出された。
【0071】
［実施例９］抗ＡＺＵ１抗体産生細胞のスクリーニング（２）
抗ＡＺＵ１抗体を産生するハイブリドーマを、実施例５で作製した分泌型ＡＺＵ１溶液を用いて、以下に示すサンドイッチＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
抗ＡＺＵ１抗体を産生するハイブリドーマを、実施例５で作製した分泌型ＡＺＵ１溶液を用いて、以下に示すサンドイッチＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
【0072】
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）で２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＦＬＡＧ抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）により３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を２００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５倍希釈した実施例５で作製した分泌型ＡＺＵ１を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
［２］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）により３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を２００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５倍希釈した実施例５で作製した分泌型ＡＺＵ１を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
【0073】
［４］ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したマウスＩｇＧ（陰性対照、ＮＣ）および市販のマウス抗ＡＺＵ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）（陽性対照、ＰＣ）ならびに無希釈のハイブリドーマ細胞培養上清を、５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［５］ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ－Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［６］ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
［５］ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ－Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［６］ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
【0074】
［７］１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
測定結果を図２に示す。７つのハイブリドーマ細胞培養上清（１－２、１－５、１－７、１－８、１－１３、１－１４および１－１５）から高いシグナルが検出された。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
測定結果を図２に示す。７つのハイブリドーマ細胞培養上清（１－２、１－５、１－７、１－８、１－１３、１－１４および１－１５）から高いシグナルが検出された。
【0075】
［実施例１０］抗ＡＺＵ１抗体産生細胞のクローニング
実施例８および実施例９の結果に基づいて選択された３つのハイブリドーマ細胞（１－２、１－８および１－１４）を、限界希釈法によりクローニングを行い、ＨＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）添加ＧＩＴ培地からＨＴを含まないＧＩＴ培地に馴化培養し、最終的に３つの抗ＡＺＵ１抗体産生細胞株（クローン１－２、１－８および１－１４）を樹立した。
実施例８および実施例９の結果に基づいて選択された３つのハイブリドーマ細胞（１－２、１－８および１－１４）を、限界希釈法によりクローニングを行い、ＨＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）添加ＧＩＴ培地からＨＴを含まないＧＩＴ培地に馴化培養し、最終的に３つの抗ＡＺＵ１抗体産生細胞株（クローン１－２、１－８および１－１４）を樹立した。
【0076】
［実施例１１］抗ＡＺＵ１モノクローナル抗体の作製
実施例１０で樹立した３つの抗ＡＺＵ１抗体産生細胞（クローン１－２、１－８および１－１４）の培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムを用いて、常法に従いモノクローナル抗体を精製した。各精製抗体をＰＢＳで透析後、２８０ｎｍにおける吸光度を測定してタンパク質濃度を定量した。
実施例１０で樹立した３つの抗ＡＺＵ１抗体産生細胞（クローン１－２、１－８および１－１４）の培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムを用いて、常法に従いモノクローナル抗体を精製した。各精製抗体をＰＢＳで透析後、２８０ｎｍにおける吸光度を測定してタンパク質濃度を定量した。
【0077】
［実施例１２］ビオチン標識抗体の作製
抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ９抗体および抗ＣＤ６３抗体（いずれもフロンティア研究所製）ならびに実施例１１で調製した３つの抗ＡＺＵ１抗体（クローン１－２、１－８および１－１４）をそれぞれ、Ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ2標識キット（同仁化学研究所製）を用いて、製品取扱説明書に記載されたプロトコルに従いビオチン標識した。
抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ９抗体および抗ＣＤ６３抗体（いずれもフロンティア研究所製）ならびに実施例１１で調製した３つの抗ＡＺＵ１抗体（クローン１－２、１－８および１－１４）をそれぞれ、Ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ2標識キット（同仁化学研究所製）を用いて、製品取扱説明書に記載されたプロトコルに従いビオチン標識した。
【0078】
［実施例１３］抗ＡＺＵ１モノクローナル抗体の性能評価（１）
実施例６で作製した２９３Ｔ、２９３Ｔ－ＡＺＵ１、ＡＣＨＮ、ＡＣＨＮ－ＡＺＵ１細胞由来の分泌微粒子を、表３に記載された８通りのサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
実施例６で作製した２９３Ｔ、２９３Ｔ－ＡＺＵ１、ＡＣＨＮ、ＡＣＨＮ－ＡＺＵ１細胞由来の分泌微粒子を、表３に記載された８通りのサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【0079】
【表3】
【0080】
具体的な方法を以下に示す。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）で４μｇ／ｍＬに希釈した表３に記載の固相抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍希釈した超遠心沈殿を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）で４μｇ／ｍＬに希釈した表３に記載の固相抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍希釈した超遠心沈殿を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
【0081】
［４］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２μｇ／ｍＬになるように希釈した表３に記載のビオチン標識抗体を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［５］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で３０分間放置した。
［６］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
［５］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で３０分間放置した。
［６］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
【0082】
［７］１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0083】
測定結果を図３および図４に示す（ＮＣは陰性対象）。抗ＡＺＵ１抗体を固相抗体、ビオチン標識抗体のいずれかに用いることにより、ＡＺＵ１を含む細胞分泌微粒子を検出可能であることが示された。特にクローン１－１４において高い検出感度を有することが示された。
以降、抗ＡＺＵ１抗体について、特に明示されていない場合はクローン１－１４を指すものとする。
以降、抗ＡＺＵ１抗体について、特に明示されていない場合はクローン１－１４を指すものとする。
【0084】
［実施例１４］抗ＡＺＵ１モノクローナル抗体の性能評価（２）
実施例６で作製した２９３Ｔ、２９３Ｔ－ＡＺＵ１、ＡＣＨＮ、ＡＣＨＮ－ＡＺＵ１細胞由来の分泌微粒子を、表４に記載された３通りのサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
実施例６で作製した２９３Ｔ、２９３Ｔ－ＡＺＵ１、ＡＣＨＮ、ＡＣＨＮ－ＡＺＵ１細胞由来の分泌微粒子を、表４に記載された３通りのサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【0085】
【表4】
【0086】
具体的な方法は、実施例１３と同様である。
測定結果を図５に示す（ＮＣは陰性対象）。抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体のいずれを固相抗体として用いても、ＡＺＵ１を含む細胞分泌微粒子を検出可能であることが示された。
測定結果を図５に示す（ＮＣは陰性対象）。抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体のいずれを固相抗体として用いても、ＡＺＵ１を含む細胞分泌微粒子を検出可能であることが示された。
【0087】
［実施例１５］健常者および胃癌患者の血清検体のＡＺＵ１測定（１）
本実施例で使用した健常者血清検体の内訳を表５に示す。健常者血清はいずれも、東ソー株式会社バイオサイエンス事業部倫理委員会の承認および検体提供者の同意を受けて、東ソー株式会社東京研究センター健康管理センターにて採取されたものである。
本実施例で使用した健常者血清検体の内訳を表５に示す。健常者血清はいずれも、東ソー株式会社バイオサイエンス事業部倫理委員会の承認および検体提供者の同意を受けて、東ソー株式会社東京研究センター健康管理センターにて採取されたものである。
【0088】
【表5】
【0089】
本実施例で使用した胃癌患者血清検体の内訳を表６に示す。胃癌患者血清はＰＲＯＭＥＤＤＸ社およびＢｉｏＩＶＴ社から購入したものである。いずれも、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。
【0090】
【表6】
【0091】
上記の血清検体を、表７に記載された６通りのサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【0092】
【表7】
【0093】
具体的な方法を以下に示す。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）で４μｇ／ｍＬに希釈した表７に記載の固相抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡおよび０．０５ｍｇ／ｍＬ異好性阻止試薬ＨＢＲ１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を含むＰＢＳで５倍希釈した血清検体を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）で４μｇ／ｍＬに希釈した表７に記載の固相抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡおよび０．０５ｍｇ／ｍＬ異好性阻止試薬ＨＢＲ１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を含むＰＢＳで５倍希釈した血清検体を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
【0094】
［４］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２μｇ／ｍＬになるように希釈した表７に記載のビオチン標識検出抗体を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［５］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［６］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
［５］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［６］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
【0095】
［７］１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0096】
６通りのサンドイッチＥＬＩＳＡにおける吸光度のボックスプロットを図６～１１に示す。６通りのサンドイッチＥＬＩＳＡにおける、健常者群および胃癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における吸光度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表８に示す。いずれのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいても、胃癌患者群において健常者群と比較して高値傾向を示し、特に実施例１５－１、１５－２、１５－６に示した固相抗体とビオチン標識抗体の組合せを用いた場合にｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
【0097】
【表8】
【0098】
［実施例１６］健常者および胃癌患者の血清検体のＡＺＵ１測定（２）
実施例１５で使用したものと同じ血清検体を、以下に示すサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、ＰＢＳで４μｇ／ｍＬに希釈したホスファチジルセリン受容体Ｔｉｍ４－ｈＦｃ（富士フイルム和光純薬製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＴＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ2および０．０５ｍｇ／ｍＬ異好性阻止試薬ＨＢＲ１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を含むＴＢＳで５倍希釈した血清検体を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
実施例１５で使用したものと同じ血清検体を、以下に示すサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、ＰＢＳで４μｇ／ｍＬに希釈したホスファチジルセリン受容体Ｔｉｍ４－ｈＦｃ（富士フイルム和光純薬製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］ＰＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］ＴＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ2および０．０５ｍｇ／ｍＬ異好性阻止試薬ＨＢＲ１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を含むＴＢＳで５倍希釈した血清検体を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
【0099】
［４］２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳで２μｇ／ｍＬになるように希釈したビオチン標識抗ＡＺＵ１抗体（クローン１－１４）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［５］２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳで５００００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［６］２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
［５］２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、１％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳで５００００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［６］２ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
【0100】
［７］１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
吸光度のボックスプロットを図１２に示す。健常者群および胃癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における吸光度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表９に示す。胃癌患者群において健常者群と比較して高値傾向を示し、ｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
吸光度のボックスプロットを図１２に示す。健常者群および胃癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における吸光度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表９に示す。胃癌患者群において健常者群と比較して高値傾向を示し、ｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
【0101】
【表9】
【0102】
［比較例１］健常者および胃癌患者血清検体のＣＥＡ測定
実施例１５および１６で使用したものと同じ血清検体を、全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー製）を評価用装置として癌胎児性抗原ＣＥＡ測定試薬（東ソー製、承認番号２０１００ＥＺＺ００１１２０００）を用いて、既存の代表的な胃癌マーカーであるＣＥＡを測定した。
実施例１５および１６で使用したものと同じ血清検体を、全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー製）を評価用装置として癌胎児性抗原ＣＥＡ測定試薬（東ソー製、承認番号２０１００ＥＺＺ００１１２０００）を用いて、既存の代表的な胃癌マーカーであるＣＥＡを測定した。
【0103】
測定値のボックスプロットを図１３に示す。健常者群および胃癌患者群のＣＥＡ濃度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間におけるＣＥＡ濃度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表１０に示す。
【0104】
【表10】
【0105】
［実施例１７］ＡＺＵ１とＣＥＡの胃癌検出性能の比較
実施例１５～１６、比較例１の測定結果に基づく、健常者群および胃癌患者群間における受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を図１４～２１に、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）および９５％信頼区間におけるＡＵＣの範囲を表１１に示す。実施例１５－１、１５－２、１５－５、１５－６、および１６において、ＣＥＡと比較してＡＵＣが上回り、優れた胃癌検出性能を有することが示された。
実施例１５～１６、比較例１の測定結果に基づく、健常者群および胃癌患者群間における受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を図１４～２１に、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）および９５％信頼区間におけるＡＵＣの範囲を表１１に示す。実施例１５－１、１５－２、１５－５、１５－６、および１６において、ＣＥＡと比較してＡＵＣが上回り、優れた胃癌検出性能を有することが示された。
【0106】
【表11】
【0107】
実施例１５および１６についてはＲＯＣ曲線解析において感度＋特異度－１で算出されるＹｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘが最大となる値を、比較例１については一般的なＣＥＡの基準値である５．０ｎｇ／ｍＬをカットオフ値として設定した場合の、感度および特異度を表１２に示す。実施例１５－１、１５－２、１５－６、および１６において、ＣＥＡと比較して感度が上回り、かつ特異度は同等であり、優れた胃癌検出性能を有することが示された。
【0108】
【表12】
【0109】
［実施例１８］乳癌患者血清検体の測定
本実施例で使用した健常者血清検体は実施例１５～１６、比較例１で使用したものと同じである。本実施例で使用した乳癌患者血清検体の内訳を表１３に示す。乳癌患者血清検体はいずれもＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したものであり、倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが製品添付書類に明記されている。
本実施例で使用した健常者血清検体は実施例１５～１６、比較例１で使用したものと同じである。本実施例で使用した乳癌患者血清検体の内訳を表１３に示す。乳癌患者血清検体はいずれもＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したものであり、倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが製品添付書類に明記されている。
【0110】
【表13】
【0111】
上記の検体を、表７の条件１～３に記載されたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。具体的な方法は、実施例１５と同様である。
【0112】
吸光度のボックスプロットを図２２～２４に示す。健常者群および乳癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における吸光度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表１４に示す。いずれのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいても、乳癌患者群において健常者群と比較して高値傾向を示し、ｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
【0113】
【表14】
【0114】
［実施例１９］大腸癌患者血清検体の測定
本実施例で使用した健常者血清検体は実施例１５～１６、比較例１で使用したものと同じである。本実施例で使用した大腸癌患者血清検体の内訳を表１５に示す。大腸癌患者血清検体はいずれもＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したものであり、倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが製品添付書類に明記されている。
本実施例で使用した健常者血清検体は実施例１５～１６、比較例１で使用したものと同じである。本実施例で使用した大腸癌患者血清検体の内訳を表１５に示す。大腸癌患者血清検体はいずれもＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したものであり、倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが製品添付書類に明記されている。
【0115】
【表15】
【0116】
上記の検体を、表７の条件１～３に記載されたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。具体的な方法は、実施例１５と同様である。
【0117】
吸光度のボックスプロットを図２５～２７に示す。健常者群および大腸癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における吸光度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表１６に示す。いずれのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいても、大腸癌患者群において健常者群と比較して高値傾向を示し、特に実施例２０－１および２０－３に示した固相抗体とビオチン標識抗体の組合せを用いた場合にｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
【0118】
【表16】
【0119】
［実施例２０］肺癌患者血清検体の測定
本実施例で使用した健常者血清検体は実施例１５～１６、比較例１で使用したものと同じである。本実施例で使用した肺癌患者血清検体の内訳を表１７に示す。肺癌患者血清検体はいずれもＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したものであり、倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが製品添付書類に明記されている。
本実施例で使用した健常者血清検体は実施例１５～１６、比較例１で使用したものと同じである。本実施例で使用した肺癌患者血清検体の内訳を表１７に示す。肺癌患者血清検体はいずれもＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したものであり、倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが製品添付書類に明記されている。
【0120】
【表17】
【0121】
上記の検体を、表７の条件１～３に記載されたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。具体的な方法は、実施例１５と同様である。
吸光度のボックスプロットを図２８～３０に示す。健常者群および肺癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における吸光度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表１８に示す。いずれのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいても、肺癌患者群において健常者群と比較して高値傾向を示し、特に実施例２０－２に示した固相抗体とビオチン標識抗体の組合せを用いた場合にｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
吸光度のボックスプロットを図２８～３０に示す。健常者群および肺癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における吸光度の範囲、およびマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表１８に示す。いずれのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいても、肺癌患者群において健常者群と比較して高値傾向を示し、特に実施例２０－２に示した固相抗体とビオチン標識抗体の組合せを用いた場合にｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
【0122】
【表18】
【0123】
［実施例２１］健常人および各種癌患者の血清検体の遊離ＡＺＵ１測定
本実施例で使用した血清検体の内訳を表１９に示す。健常者血清検体はいずれも、東ソー株式会社バイオサイエンス事業部倫理委員会の承認および検体提供者の同意を受けて、東ソー株式会社東京研究センター健康管理センターにて採取されたものである。肺癌、大腸癌、乳癌、および胃癌血清検体はいずれも、ＰＲＯＭＥＤＤＸ社およびＢｉｏＩＶＴ社から購入したものであり、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。
本実施例で使用した血清検体の内訳を表１９に示す。健常者血清検体はいずれも、東ソー株式会社バイオサイエンス事業部倫理委員会の承認および検体提供者の同意を受けて、東ソー株式会社東京研究センター健康管理センターにて採取されたものである。肺癌、大腸癌、乳癌、および胃癌血清検体はいずれも、ＰＲＯＭＥＤＤＸ社およびＢｉｏＩＶＴ社から購入したものであり、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。
【0124】
【表19】
【0125】
上記の血清検体に含まれる遊離ＡＺＵ１の濃度を、市販のＡＺＵ１ ＥＬＩＳＡキット（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製、製品番号ＳＥＫ１０６６０）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。なお、本実施例によって測定されるＡＺＵ１は、可溶性タンパク質として存在するＡＺＵ１と、細胞分泌微粒子上に存在するＡＺＵ１の両方である。
【0126】
具体的な方法を以下に示す。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したウサギ抗ヒトＡＺＵ１モノクローナル抗体を１００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、２％ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５ｍｇ／ｍＬ異好性阻止試薬ＨＢＲ１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を含むＴＢＳで１０倍に希釈された血清検体、又は前述の希釈液に組換えヒトＡＺＵ１を添加して調製した既知濃度の標準試料を１００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したウサギ抗ヒトＡＺＵ１モノクローナル抗体を１００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩放置して固相化した。
［２］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、２％ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［３］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５ｍｇ／ｍＬ異好性阻止試薬ＨＢＲ１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を含むＴＢＳで１０倍に希釈された血清検体、又は前述の希釈液に組換えヒトＡＺＵ１を添加して調製した既知濃度の標準試料を１００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。
【0127】
［４］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで０．５μｇ／ｍＬになるように希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＡＺＵ１ポリクローナル抗体を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。
［５］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を２００μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
［６］１ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［７］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
［８］組換ＡＺＵ１を標準品として検量線を作成し、検体中の遊離ＡＺＵ１濃度を算出した。
［５］０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにより３回洗浄を行い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を２００μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間放置した。
［６］１ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
［７］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
［８］組換ＡＺＵ１を標準品として検量線を作成し、検体中の遊離ＡＺＵ１濃度を算出した。
【0128】
血清検体に含まれる遊離ＡＺＵ１濃度のボックスプロットを図３１に示す。健常者群および各種癌患者群の吸光度の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における遊離ＡＺＵ１濃度の範囲、およびそれぞれの癌種群と健常者群を比較した場合のマン・ホイットニーのＵ検定のｐ値を表２０に示す。いずれの癌種においても健常者群と比較して高値傾向を示し、ｐ＜０．０５であり統計学的な有意差が認められた。
【0129】
【表20】
【産業上の利用可能性】
【0130】
本発明により、癌を簡便かつ高い精度で検出する方法、および前記方法に利用できる試薬が提供される。これらは、各種癌のスクリーニング、治療効果判定、および術後経過観察の用途に好適に用いることができるため、産業上非常に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】