特許 7565046 がんの骨転移を検出する方法及び検出試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-02

(45)【発行日】2024-10-10

(54)【発明の名称】がんの骨転移を検出する方法及び検出試薬

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20241003BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20241003BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20241003BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241003BHJP

   C07K 14/475 20060101ALN20241003BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N33/574 A

G01N27/62 V

C12N15/12

C07K14/475

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2021558347

(86)(22)【出願日】2020-11-13

(86)【国際出願番号】 JP2020042388

(87)【国際公開番号】W WO2021100621

(87)【国際公開日】2021-05-27

【審査請求日】2023-10-23

(31)【優先権主張番号】P 2019211488

(32)【優先日】2019-11-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】植村 元秀

(72)【発明者】

【氏名】野々村 祝夫

(72)【発明者】

【氏名】氏家 剛

(72)【発明者】

【氏名】明庭 昇平

(72)【発明者】

【氏名】大竹 則久

【審査官】白形 優依

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１５０３１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１９－０４５４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７４６２７２０（ＣＮ，Ａ）

【文献】WINDRICHOVA, J. et al.，MIC1/GDF15 as a Bone Metastatic Disease Biomarker，ANTICANCER RESEARCH，2017年03月，Vol.37，pp.1501-1506

【文献】SELANDER, K. S. et al.，Serum Macrophage Inhibitory Cytokine-1 Concentrations Correlate with the Presence of Prostate Cancer，Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention，2007年03月，Vol.16, No.3，pp.532-537

【文献】WINDRICHOVA, J. et al.，An Assessment of Novel Biomarkers in Bone Metastatic Disease Using Multiplex Measurement and Multiva，Technology in Cancer Research & Treatment，2018年10月21日，Vol.17，pp.1-7

【文献】DUAN, L. et al.，The role of GDF15 in bone metastasis of lung adenocarcinoma cells，ONCOLOGY REPORTS，2019年02月21日，Vol.41，pp.2379-2388

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

検体において、インタクト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）プロペプチド量を測定することを含み、前記検体は血液成分である、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出する方法。

【請求項2】

検体において、ＧＤＦ１５プロペプチド断片量を測定することを含み、前記検体は血液成分である、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出する方法。

【請求項3】

検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量とＧＤＦ１５プロペプチド断片量との合計量を測定することを含み、前記検体は血液成分である、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出する方法。

【請求項4】

前記ＧＤＦ１５プロペプチド断片が、以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に記載のＧＤＦ１５プロペプチド断片を含む、請求項２又は３に記載の方法。
（Ａ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（Ｂ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。

【請求項5】

去勢抵抗性前立腺がんではない前立腺がん、腎がん、肺がん、乳がん、甲状腺がん、膵がん、膀胱がん、大腸がん、メラノーマ、骨髄腫又はリンパ腫の骨転移を検出する、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。

【請求項6】

ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を用いて前記測定を行う
、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。

【請求項7】

質量分析法を用いて前記測定を行う、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。

【請求項8】

ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体を含み、血液成分検体に対して使用される、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出するための試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液中の増殖分化因子１５（Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １５、以降「ＧＤＦ１５」とも記す）タンパク質のプロペプチド及びその分解物を指標として、測定対象とするがん（但し、去勢抵抗性前立腺がん（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ。以下、「ＣＲＰＣ」とする）を除く）の骨転移を検出する方法及び検出試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

がんが進行するとがん細胞は転移能を有するようになり、がん組織から遊離したがん細胞は血管を通って体内の各所へと運ばれる。血流量が多い肺や肝臓、成長因子が豊富なリンパ節や骨基質は、がんの転移先となりやすいとされている。がんが骨に転移すると転移性骨腫瘍と呼ばれ、骨痛、脊髄圧迫、病的骨折、骨転移巣に対する手術、放射線療法、高カルシウム血症といった骨関連事象（Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｖｅｎｔ）が発生し、Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅや予後に悪影響を与えることが知られている。

【0003】

骨転移が疑われた場合、まずは単純Ｘ線やＣｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙによる検査で骨折のリスク評価や治療法の選択がなされる。骨シンチグラフィー、^１８Ｆ－ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ－Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ－Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ（以降「ＭＲＩ」とも記す）は、骨転移の診断に有用性が高く骨転移診療ガイドライン（２０１５年）においても推奨されている。どの方法も一長一短があり、これらの画像診断をがん種や骨転移の性質に合わせて使い分け、骨転移巣を検出する。

【0004】

体外診断マーカーとしては、表１に示す骨代謝マーカーが骨転移治療のモニタリングに有用となり得るとの報告がある。しかし、骨代謝マーカーが治療効果の直接的な予測因子であることは検証されておらず、国内外のガイドラインにおいても日常診療における使用は推奨されていない。

【0005】

画像診断は骨転移の診断において有用性が高いものの、読影者間差が生じる、被曝を伴う、装置（全身ＭＲＩ）が普及していないといった課題もある。そのため、骨転移を簡便に高い精度で検出可能なマーカーの発見および検査法の開発が望まれている。

【0006】

【表1】

【0007】

ＧＤＦ１５は、マクロファージ阻害サイトカイン１（Ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １：ＭＩＣ－１）や非ステロイド系抗炎症薬活性化遺伝子１（Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｇｅｎｅ １：ＮＡＧ－１）と同一のタンパク質であり、ＴＧＦ－βファミリーに属する。ＧＤＦ１５は分泌シグナル及びプロペプチドを含むプレプロＧＤＦ１５として発現後、分泌シグナルが切断されプロＧＤＦ１５として細胞外へ分泌される。プロＧＤＦ１５はプロペプチドを介して細胞外マトリックスに貯蔵され、フューリン様プロテアーゼによりプロペプチドから二量体を形成した状態でＧＤＦ１５が切り離され血中へ放出される（非特許文献１）。プロＧＤＦ１５は全長で分子量４０，０００付近、ＧＤＦ１５成熟体は分子量１５，０００付近に分画されることが報告されている（非特許文献２）。

【0008】

ＧＤＦ１５は、膵臓がんや大腸がん等の様々ながんで血中の成熟体量が増加することが確認されており（非特許文献３～８）、前立腺がんにおいては転移や悪性度に伴う予後判定の指標となり得るとの報告もある（非特許文献９～１２）。

【0009】

ＧＤＦ１５プロペプチドは、ＣＲＰＣ、膵臓がん、大腸がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肺小細胞がんにおいて、血中量の増加が報告されている（特許文献１～２）。特許文献１には、インタクトＧＤＦ１５プロペプチドと骨転移の指標ＥＯＤ、ＢＳＩとの間には高い相関は見られないと記載されている。しかし、その一方で、インタクトＧＤＦ１５プロペプチドが高値では骨転移等の悪性進展が認められ、ＣＲＰＣの悪性進展のマーカーとなりうることが示唆されたとも記載されている。このように特許文献１には相反する記載が見られ、ＧＤＦ１５プロペプチドと骨転移との関係は不明であった。

【0010】

なお、ＧＤＦ１５プロペプチド（以降、「ＧＤＰＰ」とも記す）は、プロＧＤＦ１５のＮ末端側に位置する１６５残基のポリペプチドである。より具体的には、本明細書におけるＧＤＦ１５プロペプチドは、配列番号１に示すヒトＧＤＦ１５のｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００４８６４）に基づくアミノ酸配列（配列番号２）において、開始メチオニンから２９残基目のアラニンまでのシグナルペプチドに続く、３０残基目のロイシンから１９４残基目のアルギニンまでの配列を少なくとも含む、又は、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】国際公開第２０１７／１５０３１４号パンフレット

【文献】特開２０１９－０４５４８６号公報

【非特許文献】

【0012】

【文献】Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ． ２０１２；１５（４）：３２０－３２８

【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；６５（６）：２３３０－２３３６

【文献】ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１４；１４：５７８－５８８

【文献】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ２０１３；８５：５９７－６０６

【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００９；１５（２１）：６６５８－６６６４

【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１１；１７：４８２５－４８３３

【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００３；９：２６４２－２６５０

【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６；１２：４４２－４４６

【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｄｅｒｓ Ｐｒｅｖ． ２００７；１６（３）：５３２－５３７

【文献】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１６；３６：１９７３－１９７８

【文献】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１７；３７（３）：１５０１－１５０５

【文献】Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． １７：１－７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、がんの骨転移を簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意検討した結果、前立腺がん（但し、ＣＲＰＣを除く）、腎がん、肺がん、乳がん、甲状腺がん、膵がん、膀胱がん、大腸がん、メラノーマ、骨髄腫又はリンパ腫の骨転移症例において、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いたイムノアッセイにより、血液中のＧＤＦ１５プロペプチドは健常検体および各種がんの非骨転移症例検体と比較して、これらのがんの骨転移症例検体で増加を示すという知見を得て、ＧＤＦ１５プロペプチドががん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出するマーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成させた。

【0015】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］検体において、インタクト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）プロペプチド量を測定することを含む、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出する方法。
［２］検体において、ＧＤＦ１５プロペプチド断片量を測定することを含む、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出する方法。
［３］検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量とＧＤＦ１５プロペプチド断片量との合計量を測定することを含む、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出する方法。
［４］前記ＧＤＦ１５プロペプチド断片が、以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に記載のＧＤＦ１５プロペプチド断片を含む、［２］又は［３］に記載の方法。
（Ａ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（Ｂ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
［５］去勢抵抗性前立腺がんではない前立腺がん、腎がん、肺がん、乳がん、甲状腺がん、膵がん、膀胱がん、大腸がん、メラノーマ、骨髄腫又はリンパ腫の骨転移を検出する、［１］～［４］の何れかに記載の方法。
［６］ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、［１］～［５］の何れかに記載の方法。
［７］質量分析法を用いて前記測定を行う、［１］～［５］の何れかに記載の方法。
［８］ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体を含む、がん（但し、去勢抵抗性前立腺がんを除く）の骨転移を検出するための試薬。

【発明の効果】

【0016】

本発明により、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬が提供される。
また、本発明の試薬はＧＤＦ１５プロペプチドを検出するものであり、ＧＤＦ１５はＴＦＧ－βファミリーの一種であるため、がん細胞から放出されるサイトカインによる破骨細胞活性化の程度を反映している可能性がある。その場合、既存の骨修飾薬（Ｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ）の治療効果を反映することが推測される。したがって、本発明の試薬は、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移治療におけるコンパニオン診断薬にもなり得る。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】良性（生検陰性）、前立腺がん（骨転移なし）および前立腺がん転移性骨腫瘍の血清における各種マーカー測定値のボックスプロットを示す図である。

【図2】前立腺がん（骨転移なし）と前立腺がん転移性骨腫瘍、または、良性（生検陰性）と前立腺がん転移性骨腫瘍の血清における各種マーカーの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を示す図である。

【図3】前立腺がん（骨転移なし）と前立腺がん転移性骨腫瘍の血清血漿同時採血品を用いた各種マーカーのＲＯＣ曲線解析の結果を示す図である。

【図4】腎がん（骨転移なし）および腎がん転移性骨腫瘍の血清における各種マーカーのボックスプロットを示す図である。

【図5】腎がん（骨転移なし）および腎がん転移性骨腫瘍の血清における各種マーカーのＲＯＣ曲線解析の結果を示す図である。

【図6】健常、肺がん転移性骨腫瘍または乳がん転移性骨腫瘍の血漿における各種マーカーのボックスプロットを示す図である。

【図7】健常、肺がん転移性骨腫瘍または乳がん転移性骨腫瘍の血漿における各種マーカーのＲＯＣ曲線解析の結果を示す図である。

【図8】ＣＲＰＣにおける骨転移なし症例および転移性骨腫瘍症例の血清における各種マーカーのボックスプロットを示す図である。

【図9】ＣＲＰＣではない前立腺がんにおける骨転移なし症例および転移性骨腫瘍症例の血清における各種マーカーのボックスプロットを示す図である。

【図10】ＣＲＰＣではない前立腺がんにおける骨転移なし症例および転移性骨腫瘍症例の血清における各種マーカーのＲＯＣ曲線解析の結果を示す図である。

【図11】肺がん（転移なし）、肺がん（骨以外への転移）および肺がん転移性骨腫瘍の検体種別各種マーカーのボックスプロットを示す図である。

【図12】肺がんにおける骨転移なし症例および転移性骨腫瘍症例の検体種別各種マーカーのＲＯＣ曲線解析の結果を示す図である。

【図13】乳がん（転移なし）、乳がん（骨以外への転移）および乳がん転移性骨腫瘍の検体種別各種マーカーのボックスプロットを示す図である。

【図14】乳がんにおける骨転移なし症例および転移性骨腫瘍症例の検体種別各種マーカーのＲＯＣ曲線解析の結果を示す図である。

【図15】健常、甲状腺がん、膵がん、膀胱がん、大腸がん、メラノーマ、骨髄腫およびリンパ腫の転移性骨腫瘍の血漿における各種マーカーのボックスプロットを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

＜１＞本発明のがん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出する方法
本発明の第一の態様は、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出する方法であり、検体においてＧＤＦ１５プロペプチド量を測定することを含む。これは、健常者および非骨転移がん患者の検体と比べて、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を有する患者の血液等の生体試料中に特徴的にＧＤＦ１５プロペプチドが存在することに基づく方法である。検体におけるＧＤＦ１５プロペプチド量の測定は、通常インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。
この方法により、後述する実施例が示すように、従来知られた骨代謝マーカー（ＡＬＰ）を測定した場合に比べて、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出する際に、高い感度と特異度で検出することができる。

【0019】

なお、本発明の方法は、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出する段階までを含むものであり、骨転移の診断に関する最終的な判断行為は含まれない。医師は、本発明の方法による検出結果等を参照して、骨転移を診断したり治療方針を立てたりする。
通常、骨転移を検出する対象（被検動物）は、ヒトである。

【0020】

本態様において測定対象であるＧＤＦ１５プロペプチドには、配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の３０残基目のロイシンから１９４残基目のアルギニンまでのアミノ酸配列、又は前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むインタクトＧＤＦ１５プロペプチド（以下、「ｉＧＤＰＰ」とも記す）と、ＧＤＦ１５プロペプチド断片とが含まれる。インタクトＧＤＦ１５プロペプチドは、プロセシングを受けていない（分解されていない）ＧＤＦ１５プロペプチドを指す。ＧＤＦ１５プロペプチド断片には、ｄＮＴ５７－ＧＤＰＰ（配列番号２のアミノ酸配列の５８残基目から１６７残基目までのアミノ酸配列、又は前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド）、ｄＮＴ７３－ＧＤＰＰ（配列番号２のアミノ酸配列の７４残基目から１６７残基目までのアミノ酸配列、又は前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド）、及びその他のペプチド断片が含まれる。その他のペプチド断片は、ＧＤＦ１５プロペプチドがプロセシングを受けた後のペプチド断片であれば特に限定されず、配列番号２のアミノ酸配列の一部の配列、又は前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドが好ましい。

【0021】

本発明の検出方法において、ＧＤＦ１５プロペプチド量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。

【0022】

ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を特異的に認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を特異的に認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を特異的に認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。

【0023】

（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を特異的に認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を特異的に認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。

【0024】

ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体としては、ＧＤＦ１５プロペプチドのＮ末端領域を特異的に認識する、例えば配列番号２の３０残基目のロイシンから５７残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が、ｉＧＤＰＰ量の測定に好ましく用いることができる。また、ＧＤＦプロペプチドのＣ末端領域を特異的に認識する、例えば配列番号２の７４残基目のグルタミン酸から１９６残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が、ｉＧＤＰＰ量とＧＤＰＰ断片量との合計量（総ＧＤＰＰ、以降「ｔＧＤＰＰ」とも記す）の測定に好ましく用いることができる。

【0025】

ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体は、ＧＤＦ１５プロペプチドそのもの、ＧＤＦ１５プロペプチドの部分領域からなるオリゴペプチド、プロＧＤＦ１５タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。

【0026】

なお、免疫原として、ＧＤＦ１５プロペプチドそのもの、またはＧＤＦ１５プロペプチドの部分領域からなるオリゴペプチドを用いると、前記タンパク質または前記オリゴペプチドを調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の抗原に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、結果として検体中に含まれるＧＤＦ１５プロペプチド量を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、プロＧＤＦ１５タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いると、免疫された動物の体内で構造変化を受けずに導入した通りのＧＤＦ１５プロペプチドタンパク質のインタクトまたは部分領域が発現されるため、検体中のＧＤＦ１５プロペプチドに対し、高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるため好ましい。

【0027】

ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。

【0028】

ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。

【0029】

本発明のがん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出する方法で用いる、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体、例えば、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＧＤＦ１５プロペプチドまたは分泌型ＧＤＦ１５プロペプチドに対する親和性に基づいて行えばよい。

【0030】

なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＧＤＦ１５プロペプチドに近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。

【0031】

本発明のがん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移の検出方法で用いる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。

【0032】

なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼなどの酵素等で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。

【0033】

本発明の検出方法において、質量分析法を利用してＧＤＦ１５プロペプチドを検出する方法について、以下に具体的に説明する。

【0034】

検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等のタンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。
測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ－ＭＳ）等により行うことができる。

【0035】

本発明の検出方法では、測定により得たＧＤＦ１５プロペプチド量が、対照から算出した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移が検出されたと判定することが好ましい。

【0036】

判定に用いるＧＤＦ１５プロペプチド量は、測定値もしくは換算濃度値の何れでもよい。なお、換算濃度値は、ＧＤＦ１５プロペプチドを標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。標準試料の濃度決定は、質量分析を用いた標準ペプチドの検量線に基づいて測定値から換算される値としてもよい。
基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、非骨転移がん患者検体と骨転移を有するがん（但し、ＣＲＰＣを除く）患者検体とをそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。

【0037】

本発明の骨転移を検出する方法は、転移性骨腫瘍を治療する方法に適用することができる。すなわち、本発明により、患者における転移性骨腫瘍を治療する方法であって、
（ｉ）ＧＤＦ１５プロペプチド量の測定値が予め設定した基準値を超えるものとして患者を同定する工程、及び
（ｉｉ）前記同定された患者に対して治療を施す工程、を含む方法が提供される。
前記工程（ｉ）の同定において、ＧＤＦ１５プロペプチド量の測定は、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体を用いて行われてもよいし、質量分析法を用いて行われてもよい。
前記工程（ｉｉ）の治療としては、外科的治療、薬物療法、放射線療法等が挙げられるが特に限定されない。

【0038】

＜２＞本発明のがん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出するための試薬
本発明の第二の態様は、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出するための試薬である。前記抗体は、通常は、配列番号２で表されるプロＧＤＦ１５の３０残基目のロイシンから１９６残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体である。

【0039】

本態様において抗体の認識対象であるＧＤＦ１５プロペプチドには、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド及び／又はＧＤＦ１５プロペプチド断片が含まれ、ＧＤＦ１５プロペプチド断片には、ｄＮＴ５７－ＧＤＰＰ、ｄＮＴ７３－ＧＤＰＰ、及びその他のペプチド断片が含まれる。これらのプロペプチド及びプロペプチド断片の説明は、前述した第一の態様に準ずる。

【0040】

本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが必要である。

【0041】

本発明の検出試薬は、さらに、骨代謝マーカーを特異的に認識する抗体を含む、骨代謝マーカーの検出試薬を含んでいてもよい。骨代謝マーカーとしては、例えば表１に示すものが挙げられる。

【0042】

本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。

【0043】

本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。

【0044】

まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。

【0045】

（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。

【0046】

（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等が好ましい。
このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。

【0047】

なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）～（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。

【0048】

次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＧＤＦ１５プロペプチドを検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。

【0049】

（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。

【0050】

（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＧＤＦ１５プロペプチド溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＧＤＦ１５プロペプチド濃度を定量する。

【0051】

検出試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、検出の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として２．５倍希釈した血清や血漿を５０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＧＤＦ１５プロペプチド量の測定を行う場合、当該検体５０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。

【0052】

本発明のがん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移検出試薬は、用手法での検出にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた検出にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた検出は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく検出が可能で、かつ短時間に検体中のＧＤＦ１５プロペプチド並びに骨代謝マーカーの濃度が定量可能であるため、好ましい。

【0053】

本発明の第二の態様の別の側面は、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体の、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出するための試薬の製造における使用である。
また、本発明の第二の態様の別の側面は、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体の、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移の検出における使用である。

【0054】

本発明のがん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出する方法及び本発明の検出試薬の対象となる検体（被検試料）は、通常はがん患者から採取したものである。より具体的には、去勢抵抗性前立腺がんではない前立腺がん、腎がん、肺がん、乳がん、甲状腺がん、膵がん、膀胱がん、大腸がん、メラノーマ、骨髄腫又はリンパ腫の患者から採取したものを挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、好ましくは去勢抵抗性前立腺がんではない前立腺がん、腎がん、肺がん、乳がんの患者から採取したものであり、更に好ましくは腎がん、肺がん、乳がんの患者から採取したものである。
すなわち、本発明の方法において好ましく検出される骨転移は、去勢抵抗性前立腺がんではない前立腺がん、腎がん、肺がん、乳がん、甲状腺がん、膵がん、膀胱がん、大腸がん、メラノーマ、骨髄腫又はリンパ腫の骨転移である。

【0055】

本発明に係る検体としては、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、脳脊髄液などが挙げられる。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を簡便かつ非侵襲的に検出できるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。
本発明において検体を検出に供する際は、患者から採取した上記血液等の試料をそのまま用いてもよく、あるいは希釈や抗凝固剤の添加等の適宜処理を施したものでもよい。検体を希釈する場合、その希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよく、例えば、血清や血漿の場合は、２．５倍希釈した検体を５０μＬ用いればよい。

【0056】

また、本発明に係る検体の採取時期は、がんと診断された後のいずれの時期でも特に限定されず、がんの初期又は進行期であってもよく、また手術療法、薬物療法、放射線療法等何らかの治療を施した後でもよく、何らかの加療後の経過観察期間であってもよく、いずれの段階で採取した検体であっても、本発明の方法に供することができる。

【実施例】

【0057】

以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。

【0058】

＜実施例１＞ ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬の調製
特許文献２の記載に基づいて２種類のＧＤＰＰ測定試薬を作製し、測定に用いた。１つはＧＤＰＰのＮ末端領域を認識する抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０２）とＣ末端領域を認識する抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４）の組み合わせで、インタクトＧＤＰＰ（ｉＧＤＰＰ）を検出する。もう一方は、Ｃ末端領域を認識する抗体の組み合わせ（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４とＴＳ－ＧＤＰＰ０８）で、ｉＧＤＰＰとＮ末端領域が欠落したＧＤＦ１５プロペプチド断片（ｄＮＴ５７－ＧＤＰＰ及びｄＮＴ７３－ＧＤＰＰを含む）の両方を検出する。後者で検出される値を、総ＧＤＰＰ（ｔＧＤＰＰ）とする。

【0059】

＜実施例２＞ 前立腺がん血清検体における転移性骨腫瘍の判別性能
本実施例で使用した血清検体パネル（計５４症例）の内訳を表２に示す。いずれも大阪大学泌尿器科学講座にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び大阪大学内の臨床研究審査委員会の承認を受けて提供された。

【0060】

【表2】

【0061】

本検討ではアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＧＤＦ１５を測定し、前立腺がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能を比較した。ＰＳＡ、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは専用測定試薬と全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－６００ＩＩ（東ソー（株）製）にて、ＧＤＦ１５は市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて測定値を算出した。ＡＬＰは採血直近の保険診療時の測定値を参照した。各種測定値のボックスプロットを図１に、マン・ホイットニーのＵ検定による有意差検定結果を表３に示す。

【0062】

【表3】

【0063】

前立腺がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能はＡＬＰを除く４種のマーカーで有意差が認められ、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰが最も高いＰ値を示した。良性である生検陰性例と前立腺がん転移性骨腫瘍の判別性能はｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＧＤＦ１５で有意差が認められ、ｔＧＤＰＰが最も高いＰ値を示した。

【0064】

次に、前立腺がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析にて実施した。解析結果を図２に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）を表４に示す。

【0065】

【表4】

【0066】

前立腺がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能および良性である生検陰性例と前立腺がん転移性骨腫瘍の判別性能はいずれもｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰがＡＬＰ含む他のマーカーと比較して優れていることが示された。

【0067】

＜実施例３＞ 前立腺がん血清／血漿同時採血検体における転移性骨腫瘍の判別性能
実施例２で解析した前立腺がん血清検体のうち、血清血漿同時採血が行われた症例（前立腺がん（骨転移なし）９例、前立腺がん転移性骨腫瘍１６例）を用いて、血清血漿間における各種マーカーの診断性能をマン・ホイットニーのＵ検定またはＲＯＣ解析で比較した。Ｕ検定のＰ値とＡＵＣを表５に、ＲＯＣ解析を図３に示す。

【0068】

【表5】

【0069】

ＧＤＦ１５およびＰＳＡの診断性能は血清血漿間で大きな差異は認められなかった。一方、ｉＧＤＰＰの診断性能は血清と比較して血漿で大幅に向上することが明らかとなった。先行研究でＧＤＰＰはプロテアーゼ等で分解を受けやすい傾向が示されており、ｉＧＤＰＰの検出は血漿を用いる方が好ましいことが示唆された。

【0070】

＜実施例４＞ 腎がん血清検体における転移性骨腫瘍の判別性能
本実施例で使用した血清検体パネル（計２９症例）の内訳を表６に示す。いずれも大阪大学泌尿器科学講座にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び大阪大学内の臨床研究審査委員会の承認を受けて提供された。

【0071】

【表6】

【0072】

本検討ではＡＬＰ、ｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＧＤＦ１５を測定し、腎がん血清検体における転移性骨腫瘍の判別性能を比較した。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは専用測定試薬と全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－６００ＩＩ（東ソー（株）製）にて、ＧＤＦ１５は市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて測定値を算出した。ＡＬＰは採血直近の保険診療時の測定値を参照した。各種測定値のボックスプロットを図４に、ＲＯＣ解析を図５に、マン・ホイットニーのＵ検定による有意差検定結果およびＲＯＣ解析によるＡＵＣを表７に示す。

【0073】

【表7】

【0074】

ＡＬＰは前立腺がんと同じく腎がんにおいても転移性骨腫瘍の判別性能が低いことが示された。一方、ｉＧＤＰＰとＧＤＦ１５は腎がん血清検体において良好な判別性能を有していることが示された。

【0075】

＜実施例５＞ 肺がんおよび乳がん血漿検体における転移性骨腫瘍の判別性能
本実施例で使用した血漿検体パネル（計２９症例）の内訳を表８に示す。健常人血清検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社より、各種がん血清検体はＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入し、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。

【0076】

【表8】

【0077】

本検討ではｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＧＤＦ１５を測定し、健常と肺がん転移性骨腫瘍または乳がん転移性骨腫瘍の判別性能を比較した。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは専用測定試薬と全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－６００ＩＩ（東ソー（株）製）にて、ＧＤＦ１５は市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて測定値を算出した。各種測定値のボックスプロットを図６に、マン・ホイットニーのＵ検定による有意差検定結果を表９に示す。

【0078】

【表9】

【0079】

肺がん転移性骨腫瘍または乳がん転移性骨腫瘍の判別性能はｉＧＤＰＰが最も優れていることが示された。ＧＤＦ１５も比較的良好な判別性能が認められたが、一部の健常人において血中濃度が上昇することが判別性能の低下にいたったものと考えられる。

【0080】

次に、肺がん転移性骨腫瘍または乳がん転移性骨腫瘍の判別性能をＲＯＣ曲線解析にて実施した。解析結果を図７に、ＡＵＣを表１０に示す。

【0081】

【表10】

【0082】

肺がん転移性骨腫瘍または乳がん転移性骨腫瘍の判別性能は、いずれもｉＧＤＰＰが最も優れていることが示された。

【0083】

本発明の上記実施例により、ＧＤＰＰプロペプチドは骨転移の指標とされるＡＬＰに比べて転移性骨腫瘍の判別性能が有意に高いことが示された。更に、血漿検体を用いた場合、ｉＧＤＰＰはＧＤＦ１５よりも転移性骨腫瘍の判別性能が優れていることが示された。

【0084】

＜実施例６＞ 去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）ではない前立腺がん（非ＣＲＰＣ）の血清検体における転移性骨腫瘍の判別性能
実施例２で使用した前立腺がん血清検体パネル（計４０症例）をＣＲＰＣ／非ＣＲＰＣ、転移性骨腫瘍なし／ありで分類した内訳を表１１に示す。

【0085】

【表11】

【0086】

本検討ではｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰ、ＧＤＦ１５およびアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を測定し、ＣＲＰＣ群および非ＣＲＰＣ群における転移性骨腫瘍の判別性能を比較した。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは専用測定試薬と全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－６００ＩＩ（東ソー（株）製）にて、ＧＤＦ１５は市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて測定値を算出した。ＡＬＰは採血直近の保険診療時の測定値を参照した。ＣＲＰＣ群の各種測定値のボックスプロットを図８に、非ＣＲＰＣ群の各種測定値のボックスプロットを図９に、マン・ホイットニーのＵ検定による有意差検定結果を表１２に示す。

【0087】

【表12】

【0088】

ＣＲＰＣ群ではいずれのマーカーも有意差が認められなかったが、非ＣＲＰＣ群ではｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰで有意差が認められた。

【0089】

次に、非ＣＲＰＣ群における転移性骨腫瘍の判別性能を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析にて実施した。解析結果を図１０に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）を表１３に示す。

【0090】

【表13】

【0091】

非ＣＲＰＣ群における転移性骨腫瘍の判別性能はｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰがＡＬＰ含む他のマーカーと比較して優れていることが示された。

【0092】

＜実施例７＞ 肺がんの血清および血漿検体における転移性骨腫瘍の判別性能
本実施例で使用した血清および血漿検体パネル（計２７症例）の内訳を表１４に示す（転移性骨腫瘍の血漿検体は実施例５と同一症例）。使用した検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社・ＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したもので、製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。

【0093】

【表14】

【0094】

本検討ではｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰを測定し、肺がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能を比較した。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは専用測定試薬と全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－６００ＩＩ（東ソー（株）製）を用いて測定値を算出した。各種測定値のボックスプロットを図１１に、マン・ホイットニーのＵ検定による有意差検定結果を表１５に示す。

【0095】

【表15】

【0096】

血清検体では有意差が認められなかったが、血漿検体ではｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰのいずれも有意差が認められた。同一症例の血清／血漿ペア検体による評価ではないため一概には言い切れないが、血清と血漿で判別性能が異なる要因としてはプロテアーゼによる分解等の検体中の安定性に起因する影響が考えられる。

【0097】

次に、肺がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析にて実施した。解析結果を図１２に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）を表１６に示す。

【0098】

【表16】

【0099】

血漿検体のｉＧＤＰＰもしくはｔＧＤＰＰの測定は、優れた肺がん転移性骨腫瘍の判別性能を有することが示された。

【0100】

＜実施例８＞ 乳がんの血清および血漿検体における転移性骨腫瘍の判別性能
本実施例で使用した血清および血漿検体パネル（計２８症例）の内訳を表１７に示す（転移性骨腫瘍の血漿検体は実施例５と同一症例）。使用した検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社・ＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したもので、製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。

【0101】

【表17】

【0102】

本検討ではｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰを測定し、乳がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能を比較した。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは専用測定試薬と全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－６００ＩＩ（東ソー（株）製）を用いて測定値を算出した。各種測定値のボックスプロットを図１３に、マン・ホイットニーのＵ検定による有意差検定結果を表１８に示す。

【0103】

【表18】

【0104】

乳がんの転移性骨腫瘍に関しては一部ＧＤＰＰ濃度が上昇する症例が存在するものの、症例数が少ないこともあり統計学的な有意差は認められなかった。

【0105】

次に、乳がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析にて実施した。解析結果を図１４に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）を表１９に示す。

【0106】

【表19】

【0107】

乳がんにおける転移性骨腫瘍判別に関しては、血漿検体のｔＧＤＰＰ測定でやや良好な性能が示された。

【0108】

＜実施例９＞ 種々のがん血漿検体における転移性骨腫瘍の判別性能
本実施例で使用した血漿検体パネル（計３４症例）の内訳を表２０に示す。使用した検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社・ＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入したもので、製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。

【0109】

【表20】

【0110】

本検討ではｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰを測定し、各種がんにおける転移性骨腫瘍の判別性能を比較した。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは専用測定試薬と全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－６００ＩＩ（東ソー（株）製）を用いて測定値を算出した。各種測定値のボックスプロットを図１５に示す。
症例数が少ないがん種もあり、十分な有意差検定の評価はできなかったが、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは健常と比較して明確に血中濃度が上昇しており、各種がんにおける転移性骨腫瘍を判別可能であることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0111】

本発明により、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移を検出することができる方法及び試薬が提供される。これにより、従来の骨代謝マーカーでは判別の難しいがん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移の有無を血液診断等で簡便かつ精度高く検出することができる。その結果、がん（但し、ＣＲＰＣを除く）の骨転移の検出を簡便にし、治療法の選択ならびに治療効果判定が可能となるため、産業上非常に有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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