令和3(行ケ)10135審決取消請求事件

令和４年１１月３０日判決言渡
令和３年（行ケ）第１０１３５号 審決取消請求事件
口頭弁論終結日 令和４年９月２８日
判 決
原 告 ザ・チルドレンズ・ホスピタル
・オブ・フィラデルフィア
10 同訴訟代理人弁護士 笠 継 正 勲
同訴訟代理人弁理士 村 越 智 史
被 告 特 許 庁 長 官
同 指 定 代 理 人 伊 藤 良 子
15 同 福 井 悟
同 吉 森 晃
同 井 上 千 弥 子
主 文
１ 原告の請求を棄却する。
20 ２ 訴訟費用は原告の負担とする。
３ この判決に対する上告及び上告受理の申立てのための付加期間を３０日
と定める。
事 実 及 び 理 由
第１ 請求
25 特許庁が不服２０１９－６６６５号事件について令和３年６月２３日にし
た審決を取り消す。
第２ 事案の概要
１ 特許庁における手続の経緯等（当事者間に争いがない。）
⑴ 原告は、発明の名称を「スタッファー／フィラーポリヌクレオチド配列を
含むベクターおよびその使用方法」とする発明について、平成２６年３月１
5 ４日に国際出願（特願２０１６－５０２９３５号。優先日平成２５年３月１
５日、優先権主張国米国。以下「本願」という。）をした。
原告は、平成３１年１月１７日付けで拒絶査定を受けたため、同年５月２
２日付けで拒絶査定不服審判（不服２０１９－６６６５号事件）を請求する
とともに、同日付けで特許請求の範囲について手続補正をした。
10 原告は、令和２年９月２日付けで拒絶理由通知を受けたため、令和３年３
月３日付けで特許請求の範囲について手続補正をし、また、同月４日付けで
特許請求の範囲について手続補正をした（以下、同日付けの補正を「本件補
正」という。）が、特許庁は、同年６月２３日、「本件審判の請求は、成り
立たない。」との審決（以下「本件審決」という。）をし、その謄本は、同
15 年７月１３日に原告に送達された（附加期間９０日）。
原告は、令和３年１１月９日、本件審決の取消しを求める本件訴訟を提起
した。
２ 特許請求の範囲の記載
本件補正後の特許請求の範囲は、請求項１ないし５０からなり、その請求項
20 １及び３０の記載は、次のとおりである（以下、本件補正後の請求項３０に係
る発明を「本願発明３０」といい、請求項１に係る発明と併せて「本願発明」
ということがある。）。
【請求項１】
異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノムと、
25 第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を含ん
でなり、
前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつアデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し、前記不活性の
フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたは
5 スタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有す
る組換えベクタープラスミド。
【請求項３０】
請求項１ないし２７のいずれかの組換えベクタープラスミドのベクターゲノ
ムを含んでなるＡＡＶ粒子。
10 ３ 本件審決の要旨
本願発明３０
本願発明３０は、本願の請求項１ないし２７を引用する形式で記載されて
いるところ、そのうちの請求項１を引用する部分に係る発明は以下のとおり
である。
15 ａ 異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノムと、
ｂ 第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を含
んでなり、
ａ－１ 前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有
し、かつアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側
20 に位置し、
ｂ－１ 前記不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列
はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置
し、該第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチ
ド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する
25 組換えベクタープラスミドの
ベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子。
本件優先日（平成２５年３月１５日）前に日本又は外国において頒布され
た刊行物（Molecular Therapy. (2009) vol.17, no.1, p.144-152。以下「引用
例１」という。）に記載された発明（以下「引用発明」という。）
「アンピシリン耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーン、及びヒト凝
5 固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子を有するＩＴＲ含有ベク
タープラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして調製された、
当該ＩＴＲ含有ベクタープラスミド由来のＤＮＡ不純物が有意に減少した組
換えＡＡＶ。」
ア 新規性欠如
10 本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」は、本願発明３０における「組換え
ベクタープラスミド」の、ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に位置
し、４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列を含む領
域と、当該領域の外側、すなわち、ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列の外側に位
置する領域に由来する残存プラスミドＤＮＡをごく少量（６０ｐｇ／１０
９
15 ｖｇ程度）含む「ベクターゲノム」を含んでなるものである。
引用発明に係る「組換えＡＡＶ」は、引用発明における「ＩＴＲ含有ベ
クタープラスミド」のＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に位置し、
「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの遺伝子」を含む領域と、
当該二つのＩＴＲ配列の外側に位置する６９８０ｂｐの領域に由来する
20 ＤＮＡ不純物を少量含む「ベクターゲノム」を含んでなるものである。
ここで、引用発明における「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎ
ｔの遺伝子」は、本願発明３０における「４．７Ｋｂを下回る長さを有す
る異種ポリヌクレオチド配列」に相当する。
また、引用発明における「ＤＮＡ不純物」は、引用発明における「ＩＴ
25 Ｒ含有ベクタープラスミド」の二つのＩＴＲ配列の外側に位置する６９８
０ｂｐの領域に由来するものであるから、本願発明３０における「残存プ
ラスミドＤＮＡ」に相当する。そして、引用例１に記載された「オーバー
サイズ（６９８０ｂｐ）のバックボーンを有するベクタープラスミドを用
いて調製された５つのロット（ロット０６００２、００３Ａ、ＮＨＰ、０
８０２、０８０３）」は、ＩＴＲ含有ベクタープラスミド由来のＤＮＡ不
5 純物を１１～１７．７ｐｇ／１０ ９ ｖｇ（平均１４．２±２．６ｐｇ／１０
９
ｖｇ）含んでいるところ、この数値は、本願明細書で示されている残存プ
ラスミドＤＮＡの量（６０ｐｇ／１０ ９ｖｇ程度）と同等であるから、引用
発明に係る「組換えＡＡＶ」のベクターゲノムに含まれている「ＤＮＡ不
純物」、すなわち、「残存プラスミドＤＮＡ」は、本願発明３０と同程度
10 にごく少量であるといえる。
そうすると、本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」に含まれている「ベク
ターゲノム」と、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」に含まれている「ベク
ターゲノム」とは、いずれも、ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に
位置し、４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列を含
15 む領域と、当該二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プ
ラスミドＤＮＡをごく少量含む点で相違ないから、そのような「ベクター
ゲノム」を含むＡＡＶである、本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」と引用
発明に係る「組換えＡＡＶ」との間にも相違はないことになる。
したがって、本願発明３０は、引用例１に記載された発明である。
20 イ 進歩性欠如
仮に、本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」と、引用発明に係る「組換え
ＡＡＶ」との間に差異があったとしても、そのような差異はわずかである
といえ、本願発明３０は、引用発明、引用例１の記載、及び本願優先日当
時のＡＡＶに関する周知技術に基づいて、当業者が容易になし得た発明で
25 あって、本願の願書に添付した明細書（甲２。以下，図面を含めて「本願
明細書」という。）の記載を参酌しても、本願発明３０が奏する効果に顕
著な点があるとはいえない。
したがって、本願発明３０は、引用発明、引用例１の記載及び本願優先
日当時のＡＡＶに関する周知技術に基づいて、当業者が容易になし得た発
明である。
5 以上のとおり、本願発明３０は、特許法２９条１項３号及び２項に該当し、
特許を受けることができないから、他の請求項に係る発明について検討する
までもなく、本願は拒絶されるべきものである。
４ 取消事由
本願発明３０の新規性及び進歩性に係る判断の誤り（引用発明との相違点の
10 看過、一致点の認定の誤り）
第３ 当事者の主張
１ 原告の主張
相違点（不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ）
の看過
15 ア 本願発明３０と引用発明を対比すると、本願発明の組換えベクタープラ
スミドは、７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する第１の不活性のフィ
ラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を有するのに対し、引用発明
のＩＴＲ含有ベクタープラスミドは、６．９８Ｋｂよりも短い不活性のフ
ィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を有する点で相違する。本
20 件審決には、この点を相違点として認定していない誤りがある。
すなわち、本願発明３０に係る請求項３０は、「請求項１のベクタープ
ラスミドのベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子」であるとの発明特定
事項を含むものであり、請求項１は「異種ポリヌクレオチド配列を含むベ
クターゲノム」との発明特定事項を含むから、本願発明３０のベクターゲ
25 ノムは、「異種ポリヌクレオチド配列」を含む。また、本願発明３０の「ベ
クターゲノム」は、異種ポリヌクレオチド配列のほかに微量ではあるが残
存ＤＮＡ不純物を含むものであるところ、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮ
Ａ不純物の量は、組換えベクタープラスミドに含まれるバックボーンの長
さによって変わる（【０１７２】、【０１７７】、図５、図６）。そして、
本願明細書の【００８３】、図５に記載されているように、第１の不活性
5 のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、ベクタープラスミ
ドのバックボーンに存在するから、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純
物の量は、組換えベクタープラスミドに含まれるバックボーン中の第１の
不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ（本願発
明３０においては７．０ないし１０．０Ｋｂ）によって変わることになる。
10 他方、引用発明の組換えＡＡＶは、アンピシリン耐性遺伝子を含む６９
８０ｂｐのバックボーンを含むベクタープラスミドをトランスフェクシ
ョンすることで調製されるものであり、バックボーンのサイズは６９８０
ｂｐであるから、そのバックボーン中のフィラー又はスタッファーポリヌ
クレオチド配列のサイズは、当然ながら６９８０ｂｐ（６．９８Ｋｂ）よ
15 りも短くなる。そうすると、引用発明の組換えＡＡＶは、６９８０ｂｐよ
り短い長さのフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列に応じた
量の残存ＤＮＡ不純物を有する。
また、後記 のとおり、本願発明３０と引用発明における各ＡＡＶ粒子
に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量の相違は、上記の不活性のフィラー又は
20 スタッファーポリヌクレオチド配列の長さの相違によるものであるとい
えるから、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長
さの相違は実質的な相違点であるといえる。
したがって、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列
の長さの違いが相違点として認定されるべきである。
25 イ これに対して、被告は、後記２ アのとおり、不活性の７．０ないし１
０．０Ｋｂの長さを有するフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配
列は、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる構成要素ではない旨主張する。
しかし、本願明細書の【０１７２】には、「ベクタープラスミド『バッ
クボーン』ＤＮＡのパッケージングが、ＩＴＲからの『逆転パッケージン
グ』を介してかなりの程度で起こり」との記載があるように、組換えベク
5 タープラスミドのＩＴＲ外側にあるバックボーンは、逆転パッケージング
というメカニズムによりＡＡＶ粒子に残存ＤＮＡ不純物としてパッケー
ジングされる。
また、前記アのとおり、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物（残存
プラスミドＤＮＡ）の量は、バックボーンの長さに応じて変わるものであ
10 り、バックボーンの長さは「不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌ
クレオチド配列」の長さによって規定されるものであるから、本願発明３
０における「第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチ
ド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」という点は、引用発
明との相違点と判断する際にＡＡＶ粒子に残存ＤＮＡ不純物がどの程度
15 含まれるかという観点から考慮されるべき発明特定事項である。
したがって、被告の主張は誤りである。
一致点（残存ＤＮＡ不純物量が同程度である。）の認定の誤り
ア 本件審決は、前記第２の３ アのとおり、本願発明におけるＤＮＡ不
純物の含有量とされている６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇと引用発明におけるＤ
20 ＮＡ不純物の含有量である１４．２±２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇとを比較し
てＤＮＡ含有量が同程度にごく少量であると結論づけている。しかし、
以下のとおり、６．９Ｋｂの長さのサイズ超過バックボーンを用いて調
製されたベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物の量の平均が６０ｐｇ／
１０ ９ ｖｇであることを理由にして、このような一致点の認定をするこ
25 とは誤りである。
本願明細書には、７．０ないし１０．０Ｋｂの長さの第１の不活性の
フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含む組換えベクタ
ープラスミドをパッケージ化したＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不
純物の量について直接の記載はないものの、本願明細書の図５には、２．
５Ｋｂのバックボーンを含むベクタープラスミドがパッケージ化され
5 た比較例としてのＡＡＶベクターのマップ（図５の上側）、７．１Ｋｂ
のバックボーンを有するベクタープラスミドがパッケージ化された実
施例２に係るＡＡＶベクターのマップ（図５の下側）が示されており、
実施例２に係るＡＡＶに含まれるＤＮＡ不純物の量は、２．５Ｋｂのバ
ックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶに
10 含まれるＤＮＡ不純物の量の約４０分の１にまで減少することが開示
されている。そして、図５には、ＡＡＶ粒子に残存するＤＮＡ不純物の
量は記載されていないが、比較例のバックボーンの長さは、引用例１に
示されている２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐ（２．６２Ｋｂ又は２．６
３８Ｋｂ）と近い２．５Ｋｂであるため、比較例におけるＡＡＶ粒子に
15 含まれるＤＮＡ不純物の量は、引用例１に示されているＤＮＡ不純物の
数値（２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐのバックボーンを有するベクター
プラスミドを用いて調製されたＡＡＶには平均値１０７．６±２７．６
ｐｇ／１０ ９ ｖｇのＤＮＡが含まれていたことが記載されている（別紙
２の１－２）。）と同程度のＤＮＡと考えられる。そうすると、７．１
20 Ｋｂのバックボーンを有するベクタープラスミドをパッケージ化され
た実施例２に係るＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量は、引用例１
に示される値の４０分の１である２．６９±０．６９ｐｇ／１０ ９ｖｇ程
度であると推定される。
また、本願明細書の【０１７７】、図６には、サイズ超過バックボー
25 ンを含まないベクタープラスミドを用いて調製されたベクター中のプラ
スミドＤＮＡ不純物の平均は、３０１ｐｇ／１０ ９ ｖｇであり、このＤＮ
Ａ不純物の量は、６．９Ｋｂの長さのサイズ超過バックボーンを用いて
調製されたベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物の量の平均である６０
ｐｇと比較して５倍であったことが開示されているが、図５には、図６
で示されている６．９Ｋｂよりも長い７．１Ｋｂの長さのサイズ超過バ
5 ックボーンを用いることで残存ＤＮＡ不純物の量が１／４０減少するこ
とが記載されているから、本願明細書の記載により、サイズ超過バック
ボーンの長さを長くすることで残存ＤＮＡ不純物の量の減少幅が大きく
なると当業者は理解することができる。そして、本願発明３０の組換え
ベクタープラスミドは、７．０ないし１０．０Ｋｂの長さの第１の不活
10 性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含むから、バッ
クボーンの長さは７．１Ｋｂを超えるものであり、７．１Ｋｂよりも長
いバックボーンを含む組換えベクタープラスミドをパッケージ化した本
願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の減少割合は、実
施例２で説明される１／４０よりも大きいと理解できる。したがって、
15 本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量は、２．６
９±０．６９ｐｇ／１０ ９ ｖｇよりも更に少なくなると理解することが
できる。
他方、引用文献１には、６９８０ｂｐのバックボーンを有するベクタ
ープラスミド（ロット ０６００２、００３Ａ、ＮＨＰ、０８０２、０
20 ８０３）で測定された平均残留プラスミドＤＮＡレベルは、１４．２±
２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇであったことが記載されている（別紙２の１－
２）。
以上を前提として、本願発明３０と引用発明とを対比すると、引用発
明のＡＡＶ粒子には、１４．２±２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇ程度のＤＮＡ不
25 純物が含まれるのに対し、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ
不純物の量は、２．６９±０．６９ｐｇ／１０ ９ ｖｇ程度かそれよりも少
なく、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量と引用発
明の組換えＡＡＶに含まれる残存ＤＮＡ不純物の量は相違している。
本願発明３０の組換えベクタープラスミドは７．０ないし１０．０Ｋ
ｂの長さの第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド
5 配列を有しており、本願明細書の【０１７７】に記載されている６．９
Ｋｂの長さのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製し
たＡＡＶ粒子は本願発明３０の技術的範囲外であるから、６．９Ｋｂの
長さのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡ
ＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量である６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇ
10 と、引用発明におけるＤＮＡ不純物の含有量を比較して同程度にごく少
量であると結論付けた本件審決の判断は、その前提において誤りがある。
イ これに対して、被告は、後記２ ア のとおり、本願明細書には、本
願発明３０の実施例は記載されておらず、加えて、ＤＮＡ不純物の量は、
同じバックボーンでもバッチによって差異が生じるから、本願発明３０
15 のＡＡＶ粒子が有するＤＮＡ不純物の量を具体的に特定することも引用
発明との間に差異を見出すこともできない旨主張する。
確かに、本願明細書には、第１の不活性のフィラー又はスタッファー
ポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する組換
えベクタープラスミドを用いて調製したＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不
20 純物を定量化したデータは含まれていないが、前記ア のとおり、引用
例１には、本願明細書の図５で比較例とされている２．５Ｋｂのバック
ボーンと近い長さを有する２．６２Ｋｂ又は２．６３８Ｋｂの長さのバ
ックボーンの長さを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＤＮ
Ａ不純物の量の平均値が記載されているから、図５の実施例２（バック
25 ボーンの長さが７．１Ｋｂの場合）におけるＤＮＡ不純物の量は推定で
きる。
また、同じバックボーンサイズでも実験条件によってＤＮＡ不純物の
量に差異が生じるが、バックボーンサイズで得られた複数のＤＮＡ不純
物の量の平均値を用いて比較を行えば問題はなく、被告の主張は理由が
ない。
5 被告は、後記２ イのとおり、本願明細書の図５には、ＤＮＡ不純物
の量が約４０分の１になるとの結論を導いた実験条件や元データの詳細
は記載されておらず、「約４０分の１」という数字には根拠がない旨主
張する。
しかし、本願明細書の実施例（【０１６１】ないし【０１７７】）で
10 は、分子生物学の分野での標準的な手法に従ってＤＮＡ不純物の量を定
量している。本願明細書の図５には具体的な実験データは記載されてい
ないが、当業者は、実施例３（【０１７３】ないし【０１７７】）に関
して明記されているＡＡＶ粒子の産生方法やＤＮＡ不純物の定量方法を
参照し、図５に示されている結果はこれと同様の標準的な手法に従って
15 定量されたＤＮＡ不純物の量に基づいて減少幅を１／４０と評価してい
ると理解できるのであるから、被告の主張は理由がない。
小括
以上のとおり、本件審決には、前記 のとおり、不活性のフィラー又はス
タッファーポリヌクレオチド配列の長さに係る実質的な相違点を看過した誤
20 り、及び前記 のとおり、残存ＤＮＡ不純物量が同程度であるとした一致点
に関する認定の誤りがあるから、このような誤った相違点及び一致点を前提
にしてされた新規性及び進歩性の判断も誤りである。
２ 被告の主張
相違点（不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ）
25 の看過の主張について
ＡＡＶベクターは、「２つのＩＴＲ配列及びその間に目的の遺伝子（治療
遺伝子）が挟まれたゲノム」を含むものであり、上記ゲノムとバックボーン
を含むベクタープラスミドそのものを丸ごと含むものではないから、ＩＴＲ
外側のバックボーン配列は、実質的にはＡＡＶベクターに含まれないもので
ある。そうすると、引用発明のＡＡＶベクターゲノムである「組換えＡＡＶ」
5 においてパッケージングされている「ベクターゲノム」は、「アンピシリン
耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーン、及びヒト凝固第Ⅸ因子をコ
ードする４２９７ｎｔの導入遺伝子を有するＩＴＲ含有ベクタープラスミド」
のうち、「アンピシリン耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーン」を
除いたものであり、２つのＩＴＲとその間に挟まれた目的遺伝子である「ヒ
10 ト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子」であることは当業
者に明らかである。
他方、本願発明３０の「ＡＡＶ粒子」に含まれている「ベクターゲノム」
は、「二つのＩＴＲ配列」及びその「内側に位置し」「４．７Ｋｂを下回る
長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」である。そして、引用発明の
15 「ヒト凝固第Ⅸ因子」は本願発明３０の「異種ポリヌクレオチド配列」に相
当し、引用発明の「４２９７ｎｔ」は本願発明３０の「４．７Ｋｂを下回る
長さ」に相当する。
そうすると、引用発明の「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの
導入遺伝子を有するＩＴＲ」は、本願発明の「二つのＩＴＲ配列」とその「内
20 側に位置し」「４．７Ｋｂを下回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド
配列」である「ベクターゲノム」に相当するから、本願発明と引用発明は、
「二つのＩＴＲ配列」とその「内側に位置し」「４．７Ｋｂを下回る長さを
有」する「異種ポリヌクレオチド配列」である「ベクターゲノム」を含む観
点において、構成要素が相違しない。
25 一致点（残存ＤＮＡ不純物量が同程度である。）の認定の誤りの主張につ
いて
ア 本願明細書の【００３５】の記載から、本願発明３０の課題は、残存
ＤＮＡ不純物量を少なくするか、又はこれを含まない組換えＡＡＶ粒子
の提供にあるといえる。これに対して、引用例１には、ＤＮＡ不純物を
最小限に抑えることが記載され（別紙２の１－１）、「ベクタープラス
5 ミドのバックボーンサイズがＤＮＡの不純物レベルに与える影響」 「ベ
、
クタープラスミドのバックボーンサイズが、組換えＡＡＶ２及びＡＡＶ
６に残留するプラスミドＤＮＡ不純物の量に及ぼす影響が評価された。 、
」
「ベクター製造用プラスミドに特大のバックボーンを使用することで、
プラスミド由来のＤＮＡ不純物の大幅な削減が達成された」（別紙２の
10 １－２）との記載があるから、引用発明の解決しようとする課題も、組
換えＡＡＶにおけるＤＮＡ不純物量を最小限に抑えることであるといえ
る。そうすると、本願発明３０と引用発明は、ＤＮＡ不純物を減少させ
るという同じ課題を有するものである。
本願明細書の【０１７１】、図１によると、ＡＡＶ粒子に含まれる残
15 存プラスミドＤＮＡは、導入遺伝子カセットサイズが２．７Ｋｂでは１
６４ｐｇ／１０ ９ｖｇ、サイズが３．７Ｋｂでは４２．７ｐｇ／１０ ９ｖ
ｇ、サイズが４．３Ｋｂでは１４．０ｐｇ／１０ ９ｖｇであることが記載
されており、導入遺伝子カセットサイズがパッケージング許容限界サイ
ズ（約４．７Ｋｂ）に近づくにつれてＤＮＡ不純物が減少することが理
20 解できるから、本願明細書には、パッケージング許容限界サイズに近い
導入遺伝子カセットサイズを採用すると、導入遺伝子カセットサイズの
長さに応じてＤＮＡ不純物が減少することが開示されているといえる。
そして、前記 のとおり、本願発明と引用発明は、「４．７Ｋｂを下
回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」を有する「ベクター
25 ゲノム」を含む点で共通するから、導入遺伝子カセットサイズにより生
じる「ＤＮＡ不純物」の量において実質的な差異はない。
また、本願明細書の【０１７２】、図５には、ベクタープラスミド「バ
ックボーン」ＤＮＡのパッケージングがＩＴＲからの「逆転パッケージ
ング」を介してかなりの程度で起こり、それはサイズ超過（＞４．７Ｋ
ｂ）のバックボーンを用いることで大幅に減少すること、サイズ超過バ
5 ックボーンを用いると残存プラスミドＤＮＡは約４０分の１（０．１～
１．０％）に減少することが記載されており、これを具体的に裏付ける
ものとして、本願明細書の【０１７７】、図６には、サイズ超過バック
ボーンを含まないベクタープラスミドを用いて調製されたベクター（Ａ
ＡＶ粒子）中の１０ ９ ｖｇ（ベクターゲノム）当たりのプラスミドＤＮＡ
10 不純物の平均は３０１ｐｇであるのに対し、サイズ超過のバックボーン
を用いて調製された１０ ９ｖｇ（ベクターゲノム）当たりのプラスミドＤ
ＮＡ不純物の平均は６０ｐｇであることが記載されている。このように、
本願明細書には、ベクタープラスミド内のサイズ超過バックボーンを用
いることにより、ウイルスベクター（ＡＡＶ粒子）中のＤＮＡ不純物が
15 大きく低減することが記載されているから、ベクタープラスミドのバッ
クボーンサイズがサイズ超過である本願発明の「ＡＡＶ粒子」は、ＤＮ
Ａ不純物が大幅に減少しているといえる。
これに対し、引用文献には、バックボーンが組換えＡＡＶ２のパッケ
ージング容量を超えるように改変した特大のバックボーンを持つプラス
20 ミドでは、プラスミドＤＮＡ不純物のレベルが大幅に減少することが記
載されている（別紙２の１－２、１－４）から、引用発明の「組換えＡ
ＡＶ」もＤＮＡ不純物が大幅に減少しているといえる。
したがって、本願発明と引用発明は、サイズ超過（＞４．７Ｋｂ）の
バックボーンを用いるものであり、大幅に減少し、ごく少量のＤＮＡ不
25 純物を有する点で一致する。
なお、本願明細書の図５には、「ＡＡＶのパッケージング許容限界を
超えるサイズ超過プラスミドバックボーン（７．１Ｋｂ）は、非ベクタ
ーＤＮＡのパッケージングを著しく低下させる。」と記載され、図５の
下の図における「ＤＮＡ Ｓｔｕｆｆｅｒ」が本願発明でいうところの
「第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」
5 に対応するが、「ＤＮＡ Ｓｔｕｆｆｅｒ」の長さは「バックボーン７．
１Ｋｂ」よりも大幅に短いことは図面上明らかである。そうすると、図
５には、「第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチ
ド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」組換えベクタープ
ラスミドのベクターゲノムを含んでなる本願発明３０のＡＡＶ粒子が記
10 載されているとはいえず、その他、本願明細書には、本願発明３０のＡ
ＡＶ粒子を具体的に裏付ける実施例の記載はない。
加えて、本願明細書の図６によると、ＤＮＡ不純物の量は、同じサイ
ズ超過バックボーンを採用したとしても、バッチ（実験条件）によって
差異が生じることが読み取れるから、本願発明３０のＡＡＶ粒子が有す
15 るＤＮＡ不純物の量を具体的に特定することも、引用発明との間に差異
を見出すこともできない。
以上のとおり、本願発明と引用発明は、「大幅に減少」し、「ごく少
量」のＤＮＡ不純物を有する点で一致し、ＤＮＡ不純物の量について差
異はなく、「ＤＮＡ不純物」の観点で相違するものではない。
20 なお、本件審決は、前記第２の３ アのとおり、本願発明３０に係る
「ＡＡＶ粒子」は、「ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域
に由来する残存プラスミドＤＮＡをごく少量（６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇ程
度） 「ベクターゲノム」
含む を含んでなるもの」と認定し、
「ごく少量」、
「程度」の文言を用いており、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる残
25 存ＤＮＡ不純物の量が６．９Ｋｂの長さを有するベクタープラスミドを
用いて調製したＡＡＶ粒子の場合と同じ６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇであると
までは認定していない。
イ これに対して、原告は、前記１ アのとおり、ＡＡＶ粒子に含まれる残
存ＤＮＡ不純物の量が組換えベクタープラスミドに含まれるバックボー
ンの長さによって変わるものであり、本願明細書の図５、図６によれば、
5 当業者は、サイズ超過バックボーンの長さを長くすることにより、残存Ｄ
ＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなることを理解することができる旨主
張する。
しかし、本願明細書には、サイズ超過のバックボーンを用いると残存Ｄ
ＮＡ不純物の量が大きく減少することが記載されているにすぎず、４．７
10 Ｋｂを超えるバックボーン同士で比較した場合において、バックボーンの
長さを長くすればするほどＤＮＡ不純物の量が減少することは記載され
ていない。前記ア のとおり、本願明細書には、本願発明３０のＡＡＶ粒
子を具体的に裏付ける実施例の記載はなく、「７．０ないし１０．０Ｋｂ
の長さを有する」配列は好ましい範囲として記載されていたものでもない。
15 そうすると、パッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）を超える範
囲で「フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」の長さを「７．
０ないし１０．０Ｋｂ」の範囲に調整することでＤＮＡ不純物の量が減少
することが本願明細書に説明されているとはいえない。
加えて、本願明細書の図５には、ＤＮＡ不純物の量が約４０分の１にな
20 るとの記載があるが、実験条件及び元データ詳細の記載はなく、図５の「１
／４０」と図６の「１／５」の数値の違いが、バックボーンの長さの差で
ある０．２Ｋｂ（７．１Ｋｂ－６．９Ｋｂ）のみに起因するとはと考えら
れない。
そうすると、本願明細書には、バックボーンの長さ又はバックボーンの
25 一部である「フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」を長く
すればするほど、残存ＤＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなることは記載
されているとはいえず、原告の主張は本願明細書の記載に基づくものでは
ない。
小括
以上によれば、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」のベクターゲノムに含ま
5 れる残存ＤＮＡ不純物、すなわち、残存プラスミドＤＮＡは、本願発明３０
と同程度にごく少量であり、本願発明３０に係るＡＡＶ粒子に含まれている
ベクターゲノムと、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」に含まれている「ベク
ターゲノム」とは、いずれもＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に位置
し、４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列を含む領域
10 と、当該二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プラスミド
ＤＮＡをごく少量含む点で相違ないから、そのような「ベクターゲノム」を
含むＡＡＶである本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」と引用発明に係る「組
換えＡＡＶ」との間には相違点は存在しない旨の本件審決の判断に誤りはな
く、原告主張の取消事由は理由がない。
15 第４ 当裁判所の判断
１ 本願明細書の記載事項について
本願明細書（甲２）には、別紙１のとおりの記載があり、この記載事項に
よれば、本願明細書の発明の詳細な説明には、本願発明３０に関して、次の
とおりの事項が開示されていると認められる。
20 ア 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ベクター中に存在す
るＤＮＡ不純物の除去のためにヌクレアーゼ処理を行ってもＤＮＡ断片
がパッケージされるなどの問題があった（【０００２】）。ＡＡＶ内のカ
プシド化した残存ＤＮＡの多くは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む
ベクタープラスミドテンプレートに由来する（【０００３】）。
25 本願の発明者らは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の本来のパ
ッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）より短いベクター発現カセ
ットを含むｒＡＡＶベクタープラスミドでは残留プラスミドＤＮＡ不純
物レベルが上昇し、配列がｒＡＡＶの本来のパッケージング許容限界サイ
ズより短いほど不純物のレベルが上昇したことを明らかにした（【００３
４】）。
5 本願発明は、ウイルス（ＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイ
ズに近いサイズの配列を有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミ
ド及び該組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドを、例えば、残存Ｄ
ＮＡ不純物量を少なくしたか、又はこれを含まない組換えウイルス粒子を
作成するために用いる方法を提供するものであり、例えば、ベクターゲノ
10 ム配列のサイズを最適化することで、抗生物質抵抗性を生じる細菌遺伝子
のような望ましくない核酸配列のベクターを介した導入に関わる潜在的
危険性を軽減することができる（【００３５】）。
イ 本願発明の組換えベクタープラスミドは、ＡＡＶ等のウイルスの野生型
ゲノムに由来し、分子学的手法を用いてウイルス（例えばＡＡＶ）から野
15 生型ゲノムを取り除き、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療的遺伝
子発現カセット）のような外来の核酸で置換したものであり、「ベクター
ゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージ又はカプシ
ド化される異種ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクタープラスミド
の一部を指すものである（【００４０】、【００８０】）。
20 ウ 本願発明の組換えベクタープラスミドは、パッケージ又はカプシド化さ
れて感染能力のあるウイルス粒子を形成するウイルスゲノム配列の正常
なサイズ、又はそれに近いサイズに長さを変更又は調節する追加的なフィ
ラー／スタッファー核酸配列を含むものであり、種々の実施形態では、フ
ィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパクをコードしな
25 い）断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）である。ＡＡＶベクターの特定の実施形態で
は、異種ポリヌクレオチド配列は、その長さが４．７Ｋｂ未満であり、フ
ィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド
配列と合わせた（例えばベクター内に挿入された）時の全長が約３．０Ｋ
ｂ～５．５Ｋｂ、４．０～５．０Ｋｂ、４．３～４．８Ｋｂである。（【０
０８２】）
5 エ 図４は、短い導入遺伝子カセットを含むベクター内のプラスミドＤＮＡ
のカプシド化を示す略図である（【００３１】）。
次に、本願明細書の発明の詳細な説明には、実施例として、次の開示があ
る。
10 ア 実施例１
カプシド化されたＤＮＡのサイズは、短い導入遺伝子カセット（２７１
６ｂｐ）を有するベクターと長い導入遺伝子カセット（４２９７ｂｐ）を
有するカセットとで同等であり、ＡＡＶウイルスのパッケージング許容限
界（４．５Ｋｂ）にほぼ対応し、短い導入遺伝子カセットを有するベクタ
15 ー内にパッケージされたＤＮＡは、ゲノムに隣接するプラスミド配列を含
むことが示された（【０１６４】、【０１６６】、図２Ｂ、図２Ｄ）。
イ 実施例２
導入遺伝子プラスミドのバックボーン内の導入遺伝子カセットの５’Ｉ
ＴＲの近傍に位置するＫａｎＲ又はＡｍｐＲ遺伝子に特異的なプライマ
ーとプローブを用いて測定された残存プラスミドＤＮＡのレベルを、２．
5 ７Ｋｂ、３．７Ｋｂ（当審注：図１には「３．９Ｋｂ」とあるが「３．７
Ｋｂ」の誤記と認める。）、４．３Ｋｂのサイズの一本鎖標準導入遺伝子
発現カセットを含むＡＡＶ２ベクターにおいて評価した結果、ｒＡＡＶ
Ａ（サイズは２．７Ｋｂ）は１６４ｐｇ／１０ ９ ｖｇ、ｒＡＡＶ Ｂ（サイ
ズは３．７Ｋｂ）は４２．７ｐｇ／１０ ９ｖｇ、ｒＡＡＶ Ｃ（サイズは４．
10 ３Ｋｂ）は１４．０ｐｇ／１０ ９ ｖｇの残存プラスミドＤＮＡをそれぞれ含
むことが示された（【０１６８】ないし【０１７１】、図１）。
また、ベクタープラスミド「バックボーン」ＤＮＡのパッケージングが、
ＩＴＲからの「逆転パッケージング」を介してかなりの程度で起こり、サ
15 イズ超過（＞４．７Ｋｂ）（当審注：【０１７２】には「＞４．７ｂｐ」
とあるが「＞４．７Ｋｂ」の誤記と認める。）のバックボーンを用いるこ
とで大幅に減少する（【０１７２】、図５）。
ウ 実施例３
サイズ超過バックボーンを用いずに調製されたベクターのＤＮＡ不純
物と、サイズ超過バックボーンを用いて調製したベクターのＤＮＡ不純物
5 を比較した結果、ベクタープラスミドバックボーンが３．８Ｋｂの長さの
場合は平均で３０１ｐｇ／１０ ９ ｖｇであったのに対して、ベクタープラ
スミドバックボーンが６．９Ｋｂの長さの場合は平均で６０ｐｇ／１０ ９
ｖｇであり、ベクタープラスミド内のサイズ超過バックボーンは、ウイル
スベクターの調製において不純物の低減に使用することができる（【０１
10 ７３】ないし【０１７７】、図６）。
前記 及び の本願明細書の開示事項によれば、本願発明３０は、残存Ｄ
ＮＡ不純物の量を少なくし、又はこれを含まない組換えＡＡＶ粒子を提供す
ることをその課題とするものであり（前記 ア）、４．７Ｋｂを下回る長さ
の異種ポリヌクレオチド配列（ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列の内側に位置する
15 もの）と、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含ん
だベクタープラスミドを用いて、上記課題を解決する（【０１６６】、図１、
図２及び図４。なお、この点については後記３ エで詳述する。）ものであ
ると認められる。
２ 引用例１の記載事項について
引用例１には、別紙２のとおりの記載（ただし、訳文は乙１による。）が
5 あり、この記載事項によれば、次のとおりの事項が開示されていると認めら
れる。
ア これまでの研究で、キャプシド形成するプラスミドＤＮＡ不純物は、主
にＩＴＲ含有ベクター製造用プラスミドのバックボーンに由来するもの
であることが報告されているところ、組換えＡＡＶ２及びＡＡＶ６に残留
10 するプラスミドＤＮＡ不純物量に対するベクタープラスミドのバックボ
ーンサイズの影響を評価した（別紙２の１－２）。
ヒト凝固第Ⅸ因子を発現するＡＡＶ２ベクター８ロットとＡＡＶ６ベク
ター２ロットは、ＡＡＶのパッケージング限界である約４７００ｎｔを超
過する６９８０ｂｐのバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて
15 作製し、比較対象として、１ロットのＡＡＶ２と４ロットのＡＡＶ６ベク
ターが、２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐのバックボーンを持つベクタープ
ラスミドを用いて作製された（別紙２の１－３、１－５）。
イ 残留プラスミドＤＮＡのレベルは、ベクター生成に使用した３つの産生
プラスミドに共通する配列であるＡｍｐ Ｒ（アンピシリン耐性遺伝子）に特
20 異的なプライマーとプローブを用いたＱ－ＰＣＲで測定した結果、特大
（６９８０ｂｐ）のバックボーンを持つベクタープラスミドを用いて作製
された５ロットで測定された平均残留プラスミドＤＮＡレベルは１４．２
±２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇであり、より小さい（２６２０ｂｐ又は２６３８
ｂｐ）バックボーンを持つベクタープラスミドを用いて作製された５ロッ
25 トで測定された平均値１０７．６±２７．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇよりも７．６
倍低く、ベクター製造用プラスミドに特大のバックボーンを使用すること
で、プラスミド由来のＤＮＡ不純物の大幅な削減が達成された（別紙２の
１－２、１－３（表１））。
ウ 今回の研究では、ＡＡＶのパッケージング限界よりも小さいバックボー
ンを持つベクタープラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入（ト
5 ランスフェクション）してＡＡＶベクターを作製したところ、得られたベ
クターに含まれるヌクレオチド耐性プラスミドＤＮＡの不純物は２．９～
５．７％であった。バックボーンがＡＡＶ２のパッケージング容量を超え
るようにスタッファー配列を改変したベクタープラスミドを使用した場
合の効果を調べると、キャプシド形成したプラスミドＤＮＡ不純物のレベ
10 ルが大幅に減少することが判明した（７．６倍）。（別紙２の１－４）。
前記 の開示事項によると、引用例１には、本件審決が認定した引用発明
（前記第２の３ ）が記載されていると認められる。
３ 取消事由（本願発明３０の新規性及び進歩性に係る判断の誤り（引用発明と
の相違点の看過、一致点の認定の誤り））について
15 本願発明３０の技術的意義について
ア 原告は、前記第３の１ のとおり、本願発明３０と引用発明を対比する
と、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さが相
違し、かつ本願発明３０と引用発明における各ＡＡＶ粒子に含まれる残存
ＤＮＡ不純物の量の相違は、この長さの相違によるものであるといえるか
20 ら、この長さの相違は実質的な相違点であるといえる旨主張するので、ま
ず、本願発明３０の技術的意義について検討する。
イ 本願発明３０に係る請求項３０は、請求項１ないし２７の「組換えベク
タープラスミド」を引用する形式で記載されている。このうち請求項１で
引用する部分に係る発明（本願発明３０）は、次のとおり特定される（下
25 線部は当審で付した。）。
「異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノムと、
第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を
含んでなり、
前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつ、
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し ①、前記
5 不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随
伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活
性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１
０．０Ｋｂの長さを有する ② 組換えベクタープラスミドの
ベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子」
10 ウ 前記イのとおり、本願発明３０は、「フィラーまたはスタッファーポリ
ヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」との構成
を有するところ、引用発明においては、この点に関する記載がないことは
明らかである。原告は、前示のとおり、本願発明３０と引用発明の相違は、
この長さの相違によるものであるといえるから、この長さの相違は実質的
15 な相違点である旨主張しているので、以下、この点について検討する。
本願発明３０は、下線部①と②で構成される組換えベクタープラスミド
のベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子であり、組換えベクタープラス
ミド自体を含んでなるとは構成されていない。ＡＡＶ粒子は、一般的に二
つのＩＴＲの間に目的の導入遺伝子を挿入したベクタープラスミド、ＡＡ
20 Ｖヘルパープラスミド、アデノウィルスヘルパープラスミドの３種類のプ
ラスミドベクターを２９３細胞にトランスフェクションし、二つのＩＴＲ
の間にある導入遺伝子がＡＡＶ内にカプシド化されるものである（乙５の
図３）から、本願発明３０の「ベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子」
とは、本願明細書の図４も参照すると、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の
25 二つのＩＴＲの内側に位置する４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリ
ヌクレオチド配列（下線部①の構成）を含むものであるとはいえるものの、
下線部②の構成に係るフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列
を含むものであるとまでは当然にはいえない。被告は、この点を重視して、
前記第３の２ のとおり、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ粒子）は、「２つのＩ
ＴＲ配列及びその間に目的の遺伝子（治療遺伝子）が挟まれたゲノム」を
5 含むものであり、上記ゲノムとバックボーンを含むベクタープラスミドそ
のものを丸ごと含むものではないから、ＩＴＲ外側のバックボーン配列は、
実質的にはＡＡＶベクターに含まれないものであるとし、本願発明と引用
発明は、「二つのＩＴＲ配列」とその「内側に位置し」「４．７Ｋｂを下
回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」である「ベクターゲノ
10 ム」を含む観点において、構成要素が相違しない旨主張する。しかし、本
件審決は、前記第２の３ アのとおり、ベクターゲノムは異種ポリヌクレ
オチド配列を含む領域にとどまらず、当該領域の外側、すなわち、ＡＡＶ
の二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プラスミドＤ
ＮＡをごく少量含むものと認定しているところであり、ベクターゲノムが
15 ＩＴＲ外側のバックボーン配列を一部なりとも含む可能性は否定し難い
し、いずれにしても本願発明３０の技術的意義が下線部①の構成に限られ
ず、下線部②の構成にも存在するのであれば、本件発明３０の構成要素と
して下線部①の構成のみを取り上げるのは相当とはいえないから、さらに、
本願発明３０の技術的意義について検討する。
20 エ 本願明細書には、「ここに開示される研究は、組換えアデノ随伴ウイ
ルス（ｒＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズ（約４．７ｋ
ｂ）より短いベクター発現カセットを含むｒＡＡＶベクタープラスミド
では、残留プラスミドＤＮＡ不純物のレベルが上昇したこと、および配
列がｒＡＡＶ本来のパッケージング許容限界サイズより短いほど不純物
25 のレベルが上昇したことを示す。・・・」（【００３４】）との記載が
あり、また、図２には、短い導入遺伝子カセット（２．７Ｋｂ）と長い
導入遺伝子カセット（４．３Ｋｂ。【０１６４】には「４．２ｋｂ」と
あるが図２には「４２９７ｂｐ」とあるので「４．３Ｋｂ」の誤記と認
める。 を含むベクタープラスミドをパッケージングした実験結果 【０
） （
１６４】）と共に、「カプシド化されたＤＮＡのサイズ（例えばベクタ
5 ーゲノムサイズと併せたＤＮａｓｅ耐性プラスミドバックボーンＤＮＡ）
は、短いゲノムを有するベクターと長いゲノムを有するベクターとで同
等であり、ＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）（当
審注：【００３４】等の記載から４．７Ｋｂの誤記であると認める。）
にほぼ対応した。短いゲノムを有するベクター内にパッケージされたＤ
10 ＮＡは、ゲノムに隣接するプラスミド配列を含み、短いゲノムを有する
ベクターは、ＡＡＶウイルスの最大パッケージング許容限界までのサイ
ズのプラスミド配列をパッケージすることが示された」 【０１６６】
（ ）
との記載がある。さらに、図４には、ＡＡＶ粒子のパッケージング許容
限界サイズ（約４．７Ｋｂ）の導入遺伝子カセットの長さがＡＡＶ粒子
15 のパッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）であるときと比較し
て、導入遺伝子カセットが短い（＜４．７Ｋｂ）場合には、ＤＮａｓｅ
に抵抗性のプラスミドＤＮＡ断片もカプシド化されることを表す略図が
開示されていることに加え、前記１ イの実施例２の開示事項を総合す
ると、異種ポリヌクレオチドをベクタープラスミドを用いてカプシド化
20 したＡＡＶ粒子には、導入遺伝子（異種ポリヌクレオチド）に隣接する
プラスミド配列もパッケージング許容限界サイズ（４．７Ｋｂ）までパ
ッケージングされること、導入遺伝子がパッケージング許容限界サイズ
より短いサイズであればあるほど、精製されたＡＡＶベクター（ＡＡＶ
粒子）に含まれるプラスミドＤＮＡ不純物の量が増えるものと理解する
25 ことができる。
また、本願明細書には、「ある態様では、フィラーまたはスタッファ
ーポリヌクレオチド配列は不活性または無害であり、機能や活性を有し
ない。・・・フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はタン
パク質やペプチドをコードする配列ではなく、フィラーまたはスタッフ
ァーポリヌクレオチド配列は異種ポリヌクレオチド配列、ＡＡＶ逆方向
5 末端反復配列（ＩＴＲ）、発現制御要素、複製起点、選択マーカーまた
はポリアデニン（ｐｏｌｙ－Ａ）配列のいずれとも異なる配列である」
（【００１２】）、「ここで定義される組換えベクタープラスミドは、
パッケージまたはカプシド化されて感染能力のあるウイルス粒子を形成
するウイルスゲノム配列の正常なサイズ、またはそれに近いサイズに長
10 さを変更または調節する、追加的なフィラー／スタッファー核酸配列を
含む。種々の実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸
の非翻訳（タンパクをコードしない） （ｓｅｇｍｅｎｔ）
断片 である。・ 」
・・
（【００８２】）、「・・・別の態様では、フィラーまたはスタッファ
ーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端およ
15 び／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’
側ＩＴＲ配列に隣接して配置されるものとする。 ・ （
・ ・」 【０００７】）
との記載があり、これらの記載を総合すると、ＩＴＲ外側の不活性のフ
ィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、残存プラスミドＤＮ
Ａと評価される組換えプラスミドベクターの配列がパッケージ又はカプ
20 シド化されることを防止するために挿入される、機能や活性を有しない
核酸の断片であると理解することができる。
前記 で指摘した本願明細書で開示されている事項を総合すると、前
記１ のとおり、本願発明３０は、残存ＤＮＡ不純物の量を少なくし、
又はこれを含まない組換えＡＡＶ粒子を提供することがその課題であ
25 ると認められるところ、本願発明３０の技術的意義は、ＡＡＶ粒子を、
二つのＩＴＲの内側に位置する異種ポリヌクレオチド配列の長さがＡ
ＡＶ粒子のパッケージング許容限界（約４．７Ｋｂ）を下回るときに、
不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチドを、導入遺伝子で
ある異種ポリヌクレオチド配列と合わせた長さが少なくともパッケー
ジング許容限界を超えるように調製されたベクタープラスミドのベク
5 ターゲノムを含むものとすることで、プラスミドに由来する残存ＤＮＡ
不純物の量を減らし，上記の課題を解決することにあるものと理解でき
る。
オ 原告は、前記第３の１ のとおり、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不
純物の量は、組換えベクタープラスミドに含まれるバックボーン中の第１
10 の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ（本願
発明３０においては７．０ないし１０．０Ｋｂ）によって変わることにな
る旨主張するところ、本願明細書には、「不活性のフィラーまたはスタッ
ファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩ
ＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたはスタッファー
15 ポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」構成
（下線部②の構成）に調製したベクタープラスミドを用いて作製されたＡ
ＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物を示す実施例の開示はない。もっと
も、本願明細書には、サイズ超過（ＡＡＶ粒子のパッケージング許容限界
の超過を意味するものと解される。）のバックボーン（７．１Ｋｂ）を有
20 するベクタープラスミドを用いると残存プラスミドＤＮＡ不純物の量は
約４０分の１（０．１～１．０％）に減少すること（図５）、サイズ超過
バックボーン６．９Ｋｂを有するベクタープラスミドを用いると、サイズ
超過していないバックボーン（３．８Ｋｂ）を有するベクタープラスミド
を用いた場合と比較して、ＤＮＡ不純物の量が約５分の１まで低減したこ
25 と（実施例３）が開示されており、ここでいう「バックボーン」とは、ベ
クタープラスミドにおける二つのＩＴＲ配列の外側の領域であり、不活性
のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が含まれるものであ
ると解される（本願明細書の図５も、ベクタープラスミドのうち、導入遺
伝子が内側に位置する二つのＩＴＲの外側にある部分をバックボーンと
記載している。）。
5 他方、本願明細書には、図５の上段と下段ではベクタープラスミドに含
まれる導入遺伝子の長さは異なるものと認められるものの、具体的な長さ
については記載がなく、また、図６にも，３．８Ｋｂと６．９Ｋｂのバッ
クボーンサイズのベクタープラスミドに含まれる導入遺伝子の長さにつ
いての記載はない。また、前記１ ア、同 ア、イ、図１及び図４の各開
10 示事項によれば、本願明細書には、パッケージング許容限界サイズ（４．
７Ｋｂ）により近い導入遺伝子カセットを採用するとＤＮＡ不純物の量が
減少し、許容限界サイズより短いほどＤＮＡ不純物の量が上昇したことが
開示されているのにとどまるから、導入遺伝子の長さに関係なく、フィラ
ー又はスタッファーポリヌクレオチドを含むバックボーンの長さを長く
15 すればするほどＤＮＡ不純物の量が著しく減るものと理解することはで
きない。
そうすると、前記図５や実施例３においてＤＮＡ不純物の量が減少した
と記載されていても、これをもって直ちに、この減少がフィラー又はスタ
ッファーポリヌクレオチドを含むバックボーンが長いことによるものと
20 理解することはできず、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列
が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有すること（下線部②）は、その長
さそれ自体に独自の技術的意義を見出すことはできないが、前記エ の技
術的意義に照らし課題の解決に資する長さを構成するという限度では有
意であると理解すべきである。
25 カ 以上によれば、本願発明３０の構成要素として下線部①の構成のみを取
り上げるのは相当とはいえず、本願発明３０の「ＡＡＶ粒子」には、下線
部②の構成がそのままパッケージ化されるものではないとしても、この構
成を含めて、引用発明との対比をすべきであるから、この点においては、
本件審決の判断には誤りがある。
本願発明３０と引用発明との対比について
5 ア 原告は、本願発明３０の下線部②の構成が本願発明３０と引用発明の実
質的な相違点であると主張するので、以下、前記 における認定を前提に
して、本願発明３０と引用発明との対比を行う。
前記 イのとおり、本願発明３０は、「前記異種ポリヌクレオチド配列
が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつ、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）
10 の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し」との構成を有する。これに対して、
引用発明は、「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子
を有するＩＴＲ含有」のベクタープラスミドの構成を有するものであると
ころ、本願発明３０の「異種ポリヌクレオチド」は、引用発明の「ヒト凝
固第Ⅸ因子」に相当し、ともに「４．７Ｋｂ」を下回るベクタープラスミ
15 ドを含む点で共通する。
イ 次に、本願発明３０は、「前記不活性のフィラーまたはスタッファーポ
リヌクレオチド配列はアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列
の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌク
レオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」構成を有する。
20 これに対して、引用発明は、「アンピシリン耐性遺伝子を含む６９８０
ｂｐのバックボーン」のベクタープラスミドの構成を有するものである。
そして、引用例１には、「ヒト凝固第Ⅸ因子（ＡＡＶ－ｈＦＩＸ）を発現
するＡＡＶ２ベクター８ロットとＡＡＶ６ベクター２ロットは、ＡＡＶの
パッケージング限界である約４７００ｎｔを超過する６９８０ｂｐのバ
25 ックボーンを含むベクタープラスミドを用いて作製した。」（別紙２の１
－５）、「バックボーンがＡＡＶ２のパッケージング容量を超えるように
スタッファー配列を改変したベクタープラスミドを使用した場合の効果
を調べたところ、この戦略により、キャプシド形成したプラスミドＤＮＡ
不純物のレベルが大幅に減少することが判明した（７．６倍、Ｐ＜０．０
０１）」（別紙２の１－４）との各記載があるから、引用発明は、バック
5 ボーンがＡＡＶのパッケージング許容限界を超えるようにスタッファー
配列を改変したベクタープラスミドを使用することで、ＡＡＶ粒子に含ま
れるプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量を減少させるという課題を解決
した発明であると理解することができる。
そうすると、本願発明３０と引用発明では、導入遺伝子とスタッファー
10 ポリヌクレオチド配列を含むベクタープラスミドを用いて調製したとき
のＡＡＶ粒子に含まれるプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量を減少させ
るという課題の共通性があり、また、前記アのとおり、導入遺伝子がいず
れもパッケージング許容限界である４．７Ｋｂを下回るものであるが、ベ
クタープラスミドの不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチ
15 ド配列の長さにおいて相違する。
しかしながら、本願発明３０においては、ベクタープラスミドのフィラ
ー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さが「７．０ないし１０．
０Ｋｂの長さ」という特定の範囲の長さであることには技術的意義がなく、
ＡＡＶ粒子を、導入遺伝子の長さがＡＡＶ粒子のパッケージング許容限界
20 （約４．７Ｋｂ）を下回るときに、不活性のフィラー又はスタッファーポ
リヌクレオチドを導入遺伝子である異種ポリヌクレオチド配列の長さと
合わせて少なくともパッケージング許容限界の長さを超えるように調製
されたベクタープラスミドのベクターゲノムを含むものとすることにそ
の技術的意義があると理解できることは、前記 エ のとおりである。そ
25 うすると、引用発明においても、バックボーンがＡＡＶのパッケージング
許容限界を超えるようにスタッファー配列を改変するものであり、導入遺
伝子の長さ（４２９７ｎｔ（約４．２９７Ｋｂ））とこのバックボーン（６
９８０ｂｐ（約６．９８０Ｋｂ））に含まれるスタッファー配列の長さが
少なくともパッケージング許容限界である４．７Ｋｂを上回るものと理解
できるから、本願発明３０と引用発明とは、その技術的意義において同一
5 であり、本願発明３０において、ベクタープラスミドのフィラー又はスタ
ッファーポリヌクレオチド配列の長さを「７．０ないし１０．０Ｋｂの長
さ」という特定の範囲の長さにしたことは実質的な相違点とはいえない。
加えて、引用発明の「６９８０ｂｐのバックボーン」は「サイズ超過バッ
クボーン」（【０１７３】ないし【０１７７】参照）であるところ、前記
10 オのとおり、本願明細書の記載からは、本願発明３０の「７．０ないし
１０．０Ｋｂの長さ」を有する「不活性のフィラーまたはスタッファーポ
リヌクレオチド配列」は、サイズ超過バックボーンを構成するものと理解
できるにすぎないから、この観点においても、両者が相違するものとはい
えない。
15 原告の主張について
ア 原告は、前記第３の１ ア のとおり、①本願明細書の図５には、７．
１Ｋｂのバックボーンを用いて調製されたＡＡＶに含まれるＤＮＡ不純
物の量は、２．５Ｋｂのバックボーンを含むベクタープラスミドを用いた
場合と比較して４０分の１にまで減少されていることが開示されており、
20 ②図５の比較例のバックボーンの長さ（２．５Ｋｂ）は引用例１に示され
ている２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐのバックボーンと近いことから、図
５の比較例の２．５Ｋｂのバックボーンを有するベクタープラスミドを用
いて調製されたＡＡＶ粒子には、引用例１に開示されている２６２０ｂｐ
又は２６３８ｂｐのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて
25 調製されたＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ残存量と同程度であるとし、その
値を前提として実施例２の７．１Ｋｂのバックボーンの長さを有するＤＮ
Ａ不純物の量（４０分の１）を推定した上で、③本願明細書の【０１７７】、
図５、図６、【０１７２】の各記載を参照することで、本願明細書には、
サイズ超過のバックボーンの長さを長くすることで残存ＤＮＡ不純物の
量の減少幅が大きくなることが開示されていることを前提として、本願発
5 明３０の組換えベクタープラスミドは７．１Ｋｂのバックボーンの長さを
超過するものであるから、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ残
存量は、②で推定された値よりも更に少ないものと理解することができる
旨主張する。
しかし、前記 オのとおり、本願明細書の図５の上段と下段では、バッ
10 クボーンの長さがそれぞれ２．５Ｋｂ、７．１Ｋｂのベクタープラスミド
であることが示されているものの、ベクタープラスミドに含まれる導入遺
伝子の長さについて記載はなく、導入遺伝子の長さは図５の上段と下段で
は異なるものと認められるため、同じ導入遺伝子を用いてバックボーンの
長さだけを調整した結果としてカプシド化した後のＡＡＶ粒子に含まれ
15 る残存ＤＮＡの量が「約４０分の１」に減少したものと読み取ることはで
きない。のみならず、下段のベクタープラスミドについて「サイズ超過バ
ックボーンを用いると残存プラスミドＤＮＡは約４０分の１（０．１～１．
０％）に減少する」との記載があるものの、その実験条件や具体的な実験
結果の記載は伴っておらず、どのように算出されたのかも不明であるから、
20 本願明細書には上記①で主張されているような事項が開示されていると
はいえず、また、図５の「２．５Ｋｂのバックボーンの長さを有する」ベ
クタープラスミドの導入遺伝子と引用例１の「２６２０ｂｐ又は２６３８
ｂｐ」のバックボーンの長さを有するベクタープラスミドの導入遺伝子が
同じものであるかは明らかでないにもかかわらず、引用例１で開示されて
25 いるＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量を参照して、本願明細書の図
５の下段の７．１Ｋｂのバックボーンの長さを有するベクタープラスミド
を用いて調製されたＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量を推定する
ことも相当ではない。
加えて、③で原告が指摘する本願明細書の記載については、そもそもベ
クタープラスミドに含まれる導入遺伝子の長さが不明であるところ、サイ
5 ズ超過のバックボーンを含まないベクタープラスミドを用いて調製され
たＡＡＶ粒子中のプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量と、サイズ超過のバ
ックボーンを含むベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶ粒子中
のプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量を比較したものにすぎず、サイズ超
過のバックボーンを有するベクタープラスミド間でバックボーンの長さ
10 とプラスミドＤＮＡ不純物の量の関係を示す実験結果ではなく、これらの
記載は、パッケージング許容限界より長いサイズ超過のバックボーンをよ
り長くすればするほどＤＮＡ不純物の量が減少することを示すものでは
ないから、本願明細書には、サイズ超過のバックボーンの長さを長くする
ことでＤＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなることが開示されていると
15 はいえない。
以上によれば、上記アの①ないし③を論拠として、本願発明３０のＡＡ
Ｖ粒子に含まれる残存ＤＮＡの量が２．６９±０．６９ｐｇ／１０ ９ｖｇよ
りも更に少ないと直ちに認めることはできないし、残存ＤＮＡの量の減少
が生じたとしても、その減少がサイズ超過のバックボーンの長さを長くし
20 たことによるものと直ちに認めることもできないから、原告の上記主張は、
その前提において誤りがある。
イ なお、本件審決は、前記第２の３ アのとおり、本願発明３０に含まれ
るＤＮＡ不純物の量は「６０ｐｇ／１０ ９ｖｇ程度」として引用発明との対
比判断をするが、この値は、実施例３の６．９Ｋｂのバックボーンの長さ
25 を有するプラスミドを用いて調製したＡＡＶ粒子に含まれるプラスミド
由来のＤＮＡの不純物の量であるところ（【０１７７】、図６）、本願発
明３０の「フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列」の長さが７．
０ないし１０．０Ｋｂを有するベクタープラスミドはこの実施例のバック
ボーンの長さを超えるものであるから、原告が前記第３の１ ア におい
て指摘するとおり、何ら説明を加えることなく，実施例３の値を参照して
5 対比判断をした本件審決の判断には相当ではない部分があるが、これまで
説示したところによれば、結論を左右するものではない。
小括
以上によれば、本願発明３０と引用発明を対比すると、本願発明３０と引
用発明における各ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量やその程度が
10 不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さにより相違
することについては、これを直ちに認めることはできず、また、不活性のフ
ィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さが相違するものの、発
明の技術的意義に照らし有意なものと認めることはできないから、この長さ
の相違は実質的な相違点であるということはできない。そうすると、本願発
15 明３０は、引用文献１に記載された発明であるといえるから、新規性を欠く
ものというべきである。原告は、その他、るる主張するが、いずれも上記結
論を左右し得ない。
４ 結論
以上によれば、原告が主張する取消事由は理由がなく、本願発明３０は、特
20 許法２９条１項３号に該当し、特許を受けることができないから、他の請求項
に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶されるべきものであると
した本件審決は、結論において相当であるから、原告の請求は棄却されるべき
である。
よって、主文のとおり判決する。
知的財産高等裁判所第４部
裁判長裁判官
菅 野 雅 之
裁判官
中 村 恭
裁判官
岡 山 忠 広
（別紙１）
本願明細書（抜粋）
【発明の詳細な説明】
5 【０００２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、今日までにいくつかの初期臨床
試験において治療用途に極めて有望であることが複数のグループによる報告で示さ
れている。この新規なクラスの生物学的製品を後期臨床試験に進め、最終的に医薬
品としての認可を得るためにはベクターの特性解析および品質管理手法を更に改善
10 する必要がある。例えば、臨床等級の精製ベクターにおける不純物プロファイルに、
ベクター設計と製造工程パラメータがどのように影響するかについての更なる理解
が必要である。ＡＡＶベクター中に存在するＤＮＡ不純物の除去は、ベクター精製
中に処理可能な核酸を効率良く取り除くことが出来るヌクレアーゼ処理を行っても、
ＤＮＡ断片がパッケージされ、ベクター粒子の完全性を保ち得るような様式で行わ
15 れるヌクレアーゼ処理に対しては抵抗性になる可能性があるという事実によって複
雑なものとなる。
【０００３】
ｒＡＡＶ作製システムの設計における重要な目的は、野生型・偽野生型ＡＡＶ種
（ｗｔＡＡＶ）、ＡＡＶ内でカプシド化された残存ＤＮＡ不純物および空のカプシ
20 ドを含む、ベクター関連不純物の特性を分析し、それらの生成を極小化・管理し得
る戦略を遂行することである。このような生成物関連不純物はベクターそのものと
酷似しており、精製過程中に真正のベクターから容易に分離できない。ベクター以
外のＤＮＡ不純物はベクター粒子精製物の総ＤＮＡ量の１～８％を占めると報告さ
れている（Ｓｍｉｔｈ ＰＨ Ｗｒｉｇｈｔ ＪＦ． Ｑｕ Ｇ． ｅｔ ａｌ ２００
25 ３， Ｍｏ． Ｔｈｅｒａｐｙ， ７：８３４８； Ｃｈａｄｅｕｆ Ｇ． Ｃｉｒｏ
ｎ Ｃ． Ｍｏｕｌｌｉｅｒ Ｐ． Ｓａｌｖｅｔｔｉ Ａ．， Ｍｏ． Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ２００５， １２：７４４． ヒト用医薬品委員会（ＣＨＭＰ）遺伝子治療 専門
家会合による報告． 欧州医薬品庁 ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ ２００５，１８３９８９
／２００４）。カプシド化した残存ＤＮＡの多くは、逆方向末端反復配列（ｉｎｖ
ｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ， ＩＴＲ）を含むベクタープラスミ
5 ドテンプレートに由来する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、組換えベクタープラスミドおよびベクターゲノムを含む（カプシド化す
る、またはパッケージする）ウイルス粒子を提供する。一実施形態では、組換えベ
10 クタープラスミドは、異種ポリヌクレオチド配列と、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）ポ
リヌクレオチド配列またはスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ポリヌクレオチド配列
を含む。
【０００５】
本発明はまた、ＡＡＶベクタープラスミドおよびＡＡＶベクターゲノムを含む（カ
15 プシド化する、またはパッケージする）ＡＡＶ粒子を提供する。一実施形態では、
組換えＡＡＶベクタープラスミドは、異種ポリヌクレオチド配列と、フィラーポリ
ヌクレオチド配列またはスタッファーポリヌクレオチド配列を含む。
【０００６】
種々の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列の長さは約４．７Ｋｂ未満とす
20 る。特定の態様では、異種ポリヌクレオチド配列は。長さが約４．７Ｋｂ未満で、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の内側に位置するものとする。
特定の態様では、異種ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌ
クレオチド配列を合わせた全体の長さは、約３．０～５．５Ｋｂ、または約４．０
～５．０Ｋｂ、または約４．３～４．８Ｋｂとする。
25 【０００７】
フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、ベクターの機能または活
性を損なわない限り、ベクター内の任意の所望の位置に配置することができる。あ
る態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌク
レオチド配列の５’ 末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側
および／または３’側ＩＴＲ配列の間には配置されないものとする。別の態様では、
5 フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列
の５’末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／また
は３’側ＩＴＲ配列の間に配置されるものとする。さらに別の態様では、フィラー
またはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’末
端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側
10 ＩＴＲ配列に隣接して配置されるものとする。またさらに別の態様では、フィラー
またはスタッファーポリヌクレオチド配列は、例えばゲノム核酸中のイントロンの
ように異種ポリヌクレオチド配列内に配置されるものとする。
【０００８】
従って、種々の実施形態では、１つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチ
15 ド配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の内側に位置する、
または、１つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、アデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の外側に位置する、または、２つのフィ
ラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列があり、第１のフィラーまたはスタ
ッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ
20 配列の内側に位置し、第２のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の外側に位置することになる。
【０００９】
さらにまた種々の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド
配列は、その長さが１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、
25 ５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２０
０～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、
７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０
００～２，５００、２，５００～３，０００、３，０００～３，５００、３，５０
０～４，０００、４，０００～４，５００、４，５００～５，０００、５，５００
～６，０００、６，０００～７，０００、７，０００～８，０００または８，００
5 ０～９，０００ヌクレオチドの配列とする。
【００１０】
さらに特定の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列がア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の間に位置する場合には、異種
ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を合わ
10 せた全体の長さは、約３．０～５．５Ｋｂ、または約４．０～５．０Ｋｂ、または
約４．３～４．８Ｋｂとする。また別の特定の態様では、フィラーまたはスタッフ
ァーポリヌクレオチド配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列
の外側に位置する場合には、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列の
長さは４．７Ｋｂを超えるものとし、約５．０～１０．０Ｋｂまたは約６．０～８．
15 ０Ｋｂとする。
【００１２】
ある態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は不活性また
は無害であり、機能や活性を有しない。種々の特定の実施形態では、フィラーまた
はスタッファーポリヌクレオチド配列は細菌のポリヌクレオチド配列ではなく、フ
20 ィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はタンパク質やペプチドをコード
する配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は異種ポリ
ヌクレオチド配列、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、発現制御要素、複製起
点、選択マーカーまたはポリアデニン（ｐｏｌｙ－Ａ）配列のいずれとも異なる配
列である。
25 【００１４】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例え
ばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例
えばＡＡＶ）粒子において、異種ポリヌクレオチド配列は転写され引き続きタンパ
クに翻訳されるか、またはそれ自体で機能や活性を有する転写物に転写され得る。
ある実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は治療効果を有するタンパク質をコ
5 ードする。特定の実施形態では、当該タンパク質は、血液凝固因子（例えば第ＸＩ
ＩＩ因子・・・）、・・・である。
【００１８】
本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例え
ばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例
10 えばＡＡＶ）粒子は、シスまたはトランスで機能する追加の要素を含む。特定の実
施形態では、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび／または組換えベ
クター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）
ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子はまた、異種ポリヌクレオチド配列の’５末端また
は３’末端に隣接する一つ以上の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、異種ポリヌクレ
15 オチド配列の転写を駆動する発現調節配列（例えば構成的または制御可能な調節配
列の様に異種ポリヌクレオチド配列の転写に寄与するプロモーターまたはエンハン
サー、または組織特異的発現調節要素）、異種ポリヌクレオチド配列の３‘に位置
するポリアデニン配列、選択マーカー（例えばカナマイシン抵抗性の様な抗生物質
抵抗性を付与するタンパク質）、および／または複製の起点を含む。
20 【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】精製されたＡＡＶベクター調製物に含まれるプラスミドＤＮＡ不純物のレ
ベルが導入遺伝子カセットの大きさに依存することを示す。
【００２８】
25 【図２】ＰＣＲおよび導入遺伝子カセットと上流側のプラスミドバックボーン配列
にわたる領域をカバーする一連のプライマーを用いて行ったベクターゲノムの５’
末端のマッピングを、ＤＮａｓｅ１処理の前後で示す。導入遺伝子カセット内部に
位置する単独のプライマー（円で囲む）を、導入遺伝子カセットと抗生物質耐性遺
伝子（ＫａｎＲおよびＡｍｐＲ）を含むプラスミドバックボーンの隣接断片の配列
にわたるプライマーと組み合わせて使用した。ＰＣＲ反応は１％アガロースゲル電
5 気泳動法で解析された。
【００２９】
図２Ａ～２Ｄは、ＤＮａｓｅ処理の前後のショートまたはロング導入遺伝子カセ
ットを含むベクターのＰＣＲを示す。
【図２Ａ】ＤＮａｓｅ処理前のショート導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含む
10 ベクターのＰＣＲを示す。
【図２Ｂ】ＤＮａｓｅ処理およびＤＮＡ精製後のショート導入遺伝子カセット（２．
７ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。
【図２Ｃ】ＤＮａｓｅ処理前のロング導入遺伝子カセット（４．３ｋｂ）を含むベ
クターのＰＣＲを示す。
15 【図２Ｄ】ＤＮａｓｅ処理およびＤＮＡ精製後のロング導入遺伝子カセット（４．
２ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。
【００３０】
図３Ａ～３Ｂは、導入遺伝子カセットを含む生産プラスミドＤＮＡに対して前述
の一連のプライマーセットを用いて行ったプラスミドコントロール（対照）ＰＣＲ
20 を、ＤＮａｓｅ １処理の前後で示す。
【図３Ａ】導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含むプラスミドを示す。
【図３Ｂ】導入遺伝子カセット（４．３ｋｂ）を含むプラスミドを示す。
【図３Ｃ】ＤＮａｓｅ処理後のプラスミドサンプルを示す。
【００３１】
25 【図４】ショート導入遺伝子カセットを含むベクター内へのプラスミドＤＮＡのカ
プシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）の略図を示す。
【００３２】
【図５】トランス（ｔｒａｎｓ）に存在するＡＡＶのパッケージング許容限界サイ
ズを超えるサイズ超過プラスミドバックボーン（７．１Ｋｂ）が、ベクター以外の
ＤＮＡのパッケージングを著しく低下させることを示す。
5 【００３３】
【図６】通常サイズ（円）対サイズ超過（三角）のバックボーンを含むベクタープ
ラスミドを用いて作成されたＡＡＶベクターの精製物中に含まれる残存プラスミド
ＤＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
10 【００３４】
ここに開示される研究は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の本来のパッケ
ージング許容限界サイズ（約４．７ｋｂ）より短いベクター発現カセットを含むｒ
ＡＡＶベクタープラスミドでは、残留プラスミドＤＮＡ不純物のレベルが上昇した
こと、および配列がｒＡＡＶの本来のパッケージング許容限界サイズより短いほど
15 不純物のレベルが上昇したことを示す。具体的な例を示すと、ｒＡＡＶのＡ（２．
７ｋｂサイズ）は１６４ｐｇ／１０ 9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ
＝９）。ｒＡＡＶのＢ（３．７ｋｂサイズ）は４２．７ｐｇ／１０ 9ｖｇの残存プラ
スミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝３２）。ｒＡＡＶのＣ（４．３ｋｂサイズ）は１
４．０ｐｇ／１０9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝２９） よって、
。
20 これらの研究は、ベクターの設計時に発現カセットの長さをウイルス（ＡＡＶ）の
カプシドの（本来の）パッケージング許容限界サイズと同じかそれに近くなるよう
に調整することで、夾雑核酸のカプシド化を低減または阻止でき、よってカプシド
化した核酸不純物を含むウイルス（ＡＡＶ）粒子が減少することを示す。
【００３５】
25 従って本発明は、ウイルス（ＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近
いサイズの配列を有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、および該組
換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドを、例えば、残存ＤＮＡ不純物量を少な
くしたかまたはこれを含まない組換えウイルス粒子を作成するために用いる方法を
提供する。例えば、ベクターゲノム配列のサイズを最適化することで、抗生物質抵
抗性を生じる細菌遺伝子の様な望ましくない核酸配列のベクターを介した導入に関
5 わる潜在的危険性を軽減できる。
【００３６】
パッケージされた（カプシド化された）領域（「ベクター」または「ベクターゲノ
ム」と称される）がウイルス（例えばＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サ
イズに近いサイズを有する本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、
10 望ましいまたは治療的効果を提供するタンパク質をコードする配列（遺伝子）の様
な異種ポリヌクレオチド配列、ならびに望ましくないまたは欠陥のある（たとえば
病原性の）遺伝子の発現を低下または阻害する抑制性（例えばアンチセンス）核酸
の導入・送達に用いることができ、従って種々の疾病を治療し得る。例えば、パッ
ケージされた（カプシド化された）領域（ベクターゲノム）がウイルス（ＡＡＶ）
15 の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズの配列を有する組換えベクタ
ー（例えばＡＡＶ）プラスミドは、Ａ型またはＢ型血友病の様な遺伝的欠損疾患、
他の代謝または血漿タンパク質の欠陥の治療、および他の治療目的のために治療的
遺伝子を導入・送達するために用いることができる。
【００４０】
20 組換え「ベクタープラスミド」および「ＡＡＶベクタープラスミド」は、ＡＡＶな
どのウイルスの野生型ゲノムに由来し、分子学的手法を用いてウイルス（例えばＡ
ＡＶ）から野生型ゲノムを取り除き、異種ポリヌクレオチド配列（例えば治療的遺
伝子発現カセット）の様な外来の核酸で置換している。通常は、ＡＡＶの場合には、
野生型ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の片方または両方がＡＡＶベ
25 クタープラスミドに残される。ウイルスゲノムの全体または一部が異種ポリヌクレ
オチド配列によって置換されており、該異種ポリヌクレオチド配列は通常はウイル
ス（例えばＡＡＶ）ゲノム核酸に対しては外来の核酸であるので、ウイルスベクタ
ー（例えばＡＡＶ）はウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムとは区別される。
【００７８】
「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドの挿入または組み込みによって操作
5 することができるプラスミド、ウイルス（例えばＡＡＶベクター）、コスミドまた
は他の輸送媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を指す。そのようなベクターは、ポリヌクレオ
チドを細胞内に導入・移入し、細胞内に挿入されたポリヌクレオチドを転写または
翻訳するための遺伝子操作（すなわち「クローニングベクター」）に用いることが
できる。ベクタープラスミドは一般に、細胞内で増殖するための複製起点を少なく
10 とも一つ含み、随意に、異種ポリヌクレオチド配列、発現調節因子（例えばプロモ
ーター、エンハンサー）、選択マーカー（例えば抗生物質抵抗性）、ポリアデニン
配列のような追加因子を含む。
【００８０】
組換えベクタープラスミドについては、ベクターゲノムは、ウイルス（例えばＡＡ
15 Ｖ）によってパッケージまたはカプシド化され、異種ポリヌクレオチド配列を含む
ベクタープラスミドの一部を指す。組換えベクタープラスミドのプラスミド部位は、
ヘルパー細胞のトランスフェクションおよび細胞によるベクターゲノムをパッケー
ジ／カプシド化するウイルスの産生に用いられるバックボーン配列を含むが、それ
自体はウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージ／カプシド化されない。
20 【００８２】
ここで定義される組換えベクタープラスミドは、パッケージまたはカプシド化さ
れて感染能力のあるウイルス粒子を形成するウイルスゲノム配列の正常なサイズ、
またはそれに近いサイズに長さを変更または調節する、追加的なフィラー／スタッ
ファー核酸配列を含む。種々の実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、
25 核酸の非翻訳（タンパクをコードしない）断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）である。ＡＡＶ
ベクターの特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、その長さが４．７
Ｋｂ未満であり、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリ
ヌクレオチド配列と合わせた（例えばベクター内に挿入された）時の全長が約３．
０～５．５Ｋｂ、または４．０～５．０ｋｂ、または４．３～４．８ｋｂである。 ・
・ ・
【００８３】
5 ここで開示されるように、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、
異種ポリヌクレオチド配列、調節因子、ＩＴＲ、複製起点、選択マーカー等の他の
配列に対して、組換えベクタープラスミド内のベクター機能と両立できる任意の位
置にあってよい。ある特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオ
チド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の３’末端と５’末端にそれぞれ隣接する
10 ３’ＩＴＲと５’ＩＴＲとの間に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおい
ては、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラ
スミドのベクターゲノム部分内に存在し、従ってウイルスのパッケージ／カプシド
化に用いられる。別の特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオ
チド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の３’末端と５’末端にそれぞれ隣接する
15 ３’ＩＴＲと５’ＩＴＲの外側に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおい
ては、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラ
スミドのバックボーンまたはプラスミド部分内に存在する。また別の特定の形態で
は、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド
配列の内部に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおいては、異種ポリヌク
20 レオチド配列の内部に位置するフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列
は、組換えベクタープラスミドのベクターゲノム部分内に存在し、従ってウイルス
のパッケージ／カプシド化に用いられる。
実施例
実施例１
25 【０１６２】
標準的ＰＣＲを、ＰＣＲ増幅の陽性対照としてＡＡＶベクターゲノム配列を含む
プラスミッドＤＮＡ（図３、パネルＡとＢ）、精製ベクター調製物から抽出された
ベクターゲノムＤＮＡ（図２、パネルＡとＣ、それぞれベクターゲノムサイズが２．
７Ｋｂおよび４．２Ｋｂ）、およびベクターをＤＮａｓｅ Ｉで処理した後抽出され
たベクターゲノムＤＮＡ（図２、パネルＢとＤ、それぞれベクターゲノムサイズが
5 ２．７Ｋｂおよび４．２Ｋｂ）に対して実施した。導入遺伝子カセット内に位置す
るプライマー（図の赤丸）は、導入遺伝子カセット中の配列と、抗生物質耐性遺伝
子（ＫａｎＲまたはＡｍｐＲ）を含むプラスミドバックボーンの隣接断片中の配列
とをカバーする一組のプライマーと対を構成し、それぞれのＰＣＲに用いられた。
ＰＣＲ反応物は１％アガロース／ＥｔＢｒゲル電気泳動法によって解析された。
10 【０１６３】
図３のデータ、ＰＣＲ増幅の対照、プラスミドＤＮＡ。プラスミドＤＮＡがテンプ
レートとして用いられたとき、すべてのプライマー対（９プライマー対、パネルＡ
とＢ）についてＰＣＲ断片が生成し、本研究で使われたすべてのプライマー対がＰ
ＣＲ産物を生成することが示唆された。すべてのＰＣＲ産物は、プラスミド配列と
15 プライマーの位置に基づいて予測される期待されたサイズを示した。期待されたと
おり、ＰＣＲ前にプラスミドサンプルがＤＮａｓｅ Ｉで処理された場合には、ＰＣ
Ｒ増幅は認められなかった（パネルＣ）。
【０１６４】
図２のデータ。精製されたベクターから抽出されたＤＮＡに対してＰＣＲが行わ
20 れたときには、一組のプライマー対のみが実験でＰＣＲ産物を与えた（２．７Ｋｂ
の短いゲノムを有するベクターに６プライマー対（パネルＡとＢ）、４．２Ｋｂの
長いゲノムを有するベクターに４プライマー対（パネルＣとＤ））。ＰＣＲ産物の
最大のサイズ（ＰＣＲ増幅の外側のベクターゲノム配列と併せて）は、増幅された
ＤＮＡの最大サイズがＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）と
25 対応することを示した。
【０１６５】
ベクターからＤＮＡを抽出する前にベクター調製物を ＤＮａｓｅ Ｉで処理して
も（図２、パネルＢとＤ）、ＰＣＲ増幅パターンに変化は認められなかった（図２、
パネルＡとＣを、それぞれパネルＢとＤと比較）。すなわち、ＰＣＲ産物を生成す
るプライマー対の数とＰＣＲ産物のサイズに変化は無く、ＰＣＲによって増幅され
5 た配列（ベクターゲノムおよび隣接配列）は、ＤＮａｓｅから保護され、カプシド
化されていることが示唆された。
【０１６６】
カプシド化されたＤＮＡのサイズ（例えばベクターゲノムサイズと併せたＤＮａ
ｓｅ耐性プラスミドバックボーンＤＮＡ）は、短いゲノムを有するベクターと長い
10 ゲノムを有するベクターとで同等であり、ＡＡＶウイルスのパッケージング許容限
界（４．５Ｋｂ）にほぼ対応した。短いゲノムを有するベクター内にパッケージさ
れたＤＮＡは、ゲノムに隣接するプラスミド配列を含み、短いゲノムを有するベク
ターは、ＡＡＶウイルスの最大パッケージング許容限界までのサイズのプラスミド
配列をパッケージすることが示された。
15 実施例２
【０１６７】
この実施例は、ＧＭＰ適合の製造工程を用いた組換えＡＡＶウイルスの生成およ
び精製についての記述を含む。
【０１６８】
20 残存プラスミドＤＮＡのレベルは、以下のサイズ範囲の一本鎖標準導入遺伝子発
現カセットを含む一連のＡＡＶ２ベクターにおいて評価された。すなわち、ｒＡＡ
Ｖ Ａは２．７ｋｂ（野生型のサイズの５７％）、ｒＡＡＶ Ｂは３．７ｋｂ（野生
型の８３％）、およびｒＡＡＶ Ｃは４．３ｋｂ（野生型の９１％）である。構築物
毎に複数のロットを、同一のプロセスを用いて生成および精製した。ベクターは、
25 ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスを必要としないトランスフェクションによっ
て作出され、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｆｏｒｏｓ ＳＯＨＳ）とｉｓＯＱ
ＶＣｎｉｃ塩化セシウム超遠心の併用により精製された。
【０１６９】
残存プラスミドＤＮＡの濃度は、ベクター調製物１ｍｌ当たりのＫａｎＲ遺伝子
コピー数として測定され、ＫａｎＲ（ＡｍｐＲ）のコピー数は完全長プラスミドの
5 コピー数を示す（最悪の場合でも）と仮定して、ベクターゲノム（ｖｇ）の％、ま
たは１０ ９ ｖｇ当たりのｐｇとして表した。ベクターの力価および残存プラスミド
ＤＮＡの濃度は、導入遺伝子プラスミドのバックボーン内の導入遺伝子カセットの
５’ＩＴＲの近傍に位置するＫａｎＲまたはＡｍｐＲ遺伝子に特異的なプライマー
とプローブを用い、ＴａｑＭａｎ技術を製造者のプロトコールに従って使用してリ
10 アルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定された。
【０１７０】
ＤＮａｓｅ実験では、１ｘ１０ 6 コピーのベクターゲノムまたはプラスミドが、５
ＵのＤＮａｓｅ １によって消化された。増幅は、ＰＣＲ反応毎に５００コピー数の
ベクターゲノムまたはプラスミドを用いて標準的ＰＣＲによって行われた。短い導
15 入遺伝子カセットを有するＡＡＶベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物は、ＤＮａ
ｓｅに抵抗性であり、ベクタープラスミドのＩＴＲの近傍のプラスミドＤＮＡ断片
がカプシド化されたことが示された。
【０１７１】
残存プラスミドＤＮＡは、ベクターサンプル中の標的ｑＰＣＲ増幅産物のコピー
20 数の測定値に基づき、保守的方法により定量された。すなわち、コピー数にプラス
ミドのＭｒを乗じて算出された。導入遺伝子カセットサイズの関数としての不純物
レベルを図１に要約した。評価により、ｒＡＡＶ Ａ（サイズは２．７ｋｂ）は１６
４ ｐｇ／１０9ｖｇ（ｎ＝９）、ｒＡＡＶ Ｂ（サイズは３．７ｋｂ）は４２．７ｐ
ｇ／１０ 9ｖｇ（ｎ＝３２）、そして ｒＡＡＶ Ｃ（サイズは４．３ｋｂ）は１４．
25 ０ｐｇ／１０9ｖｇ（ｎ＝２９）の残存プラスミドＤＮＡをそれぞれ含むことが示さ
れた。
【０１７２】
さらに、ベクタープラスミド「バックボーン」ＤＮＡのパッケージングが、ＩＴＲ
からの「逆転パッケージング」を介してかなりの程度で起こり、それはサイズ超過
（＞４．７ｂｐ）のバックボーンを用いることで大幅に減少する（図５）。
5 実施例３
【０１７３】
この実施例は、サイズ超過バックボーンを用いずに調製されたベクターのＤＮＡ
不純物を、サイズ超過バックボーンを用いて調製したベクターと比較した研究につ
いての記述を含む。
10 【０１７４】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の一過性トランスフェクションによるベクター
産生に基づき、以下に記述するベクター産生および精製方法に従い、一連の１２バ
ッチの組換えＡＡＶベクターを同一の方法で調製した。
ＨＥＫ２９３細胞培養におけるベクター産生：
15 １．Ｔ７５フラスコ内でＨＥＫ２９３のマスター・セル・バンク細胞の培養を開始
２．細胞を約二個のＴ２２５フラスコに継代
３．細胞を約二個のローラーボトルに継代
４．細胞を約１０個のローラーボトルに継代
５．細胞を約１０２個のローラーボトルに継代
20 ６．サイズ超過ベクターバックボーンを有するべクタープラスミド、またはサイズ
超過ベクターバックボーンを有しないべクタープラスミドを含むプラスミドＤＮＡ
で細胞をトランスフェクション
７．無血清培地に交換
ベクター精製（下流工程）：
25 ８．ベクター含有細胞および培養液の回収
９．回収物のタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ （ＴＦＦ））（１００ ｋＤａ）による濃縮および透析ろ過
１０．濃縮された回収物の微細流動化
１１．微細流動化中間産物のろ過（０．６５μｍ／０．２μｍ連続細孔径）
１２．イオン交換クロマトグラフィーによる精製
5 １３．塩化セシウム等密度勾配超遠心法による精製
１４．ＴＦＦ（１００ ｋＤａ）によるバッファー交換
１５．製剤化および０．２μｍろ過による精製バルクベクターの調製
１６．最終０．２μｍろ過、バイアルへの充填、仕上げによるバイアル充填された
精製ベクターの調製
10 【０１７５】
サイズ超過バックボーンを含む生産プラスミドベクターを用いて調製された９バ
ッチのベクター、およびサイズ超過バックボーンを含まない生産プラスミドベクタ
ーを用いて調製された３バッチのベクターの精製ベクターのサンプルを、精製され
たベクター生産物の一部であることが意図されない（よって不純物である）アンピ
15 シリンおよびカナマイシン抵抗性遺伝子の残存レベルのｑＰＣＲ測定によって決定
される残存宿主細胞プラスミドＤＮＡの測定に供した。この不純物の測定に用いた
方法を以下に記す。
リアルタイムｑＰＣＲによる残存プラスミドＤＮＡ
【０１７６】
20 記述されたＴａｑＭａｎR リアルタイムｑＰＣＲ手法は、標的特異的Ｑ－ＰＣＲ
プライマーおよびプローブを用いて、ベクター生成に用いられた生産プラスミド内
の特異的配列（Ａｍｐ R またはＫａｎR）を検出する。一つの標的がベクター製造で
用いられたすべてのプラスミドに共通である場合には、総残存プラスミドは単回の
ｑＰＣＲ試験で決定された。Ａｍｐ R およびＫａｎ R の両方がある特定のバッチの一
25 つ以上の生産プラスミド内に存在する場合には、総残存プラスミドはそれぞれ別々
の試験で決定されたＡｍｐ R の残渣ＤＮＡとＫａｎ R の残渣ＤＮＡの和として算出
された。・・・
【０１７７】
図６に示される１２の定量結果で得られた残存プラスミドＤＮＡ不純物レベルに
おいては、サイズ超過バックボーンを含まない（欠く）ベクタープラスミドを用い
5 て調製されたベクター中の１０ 9 ベクターゲノム当たりのプラスミドＤＮＡ不純物
の平均は３０１ｐｇで、これはサイズ超過バックボーンを用いて調製されたベクタ
ーで測定された１０ 9ｖｇ当たりのプラスミドＤＮＡ不純物の平均である６０ｐｇ
と比較して、５倍高い値であった。従って、ベクタープラスミド内のサイズ超過バ
ックボーンは、ウイルスベクターの調製において不純物の低減に使用することがで
10 きる。
（別紙２）
（１－１）
「・・・臨床用ベクター中のキャプシド形成するＤＮＡ不純物を最小限に抑える
ため、次の２つの方法が用いられた。（ⅰ）ＡＡＶのパッケージング限界を超え
5 るバックボーンを持つベクター（cis）製造用プラスミド；および（ⅱ）ベクター
に関連する不純物（例：空キャプシド）からベクターの分離を達成するベクター
精製工程。結論として、ＡＡＶ２－ｈＦＩＸ臨床用ベクターによる導入後、残留
ｃａｐの発現は検出されなかった。」（１頁左欄１４～２０行）
10 （１－２）
「ベクタープラスミドのバックボーンサイズがＤＮＡの不純物レベルに与える
影響
これまでの研究では、キャプシド形成するプラスミドＤＮＡ不純物は、主にＩ
ＴＲ含有ベクター（cis）製造用プラスミドのバックボーンに由来することが報告
15 されていた。ベクタープラスミドのバックボーンサイズが、組換えＡＡＶ２およ
びＡＡＶ６における残留プラスミドＤＮＡ不純物の量に及ぼす影響が評価され
た。残留プラスミドＤＮＡのレベルは、ベクター生成に使用した３つの産生プラ
スミドに共通する配列であるＡｍｐ Ｒ に特異的なプライマーとプローブを用いた
Ｑ－ＰＣＲで測定した（表１）。この実験で比較したベクターは、それぞれ共通
20 の方法（chromatography-gradient）で生成及び精製されているため、ベクター
の純度が高く、空キャプシドが除去されており、また非キャプシド形成型核酸の
不純物が除去された、効率的なヌクレアーゼ消化工程が含まれた。ベクタープラ
スミドを用いて生成した５ロットの平均残留プラスミドＤＮＡレベルを測定し
たところ、特大（６９８０ｂｐ）のバックボーンを持つプラスミド（ロット ０
25 ６００２、００３Ａ、ＮＨＰ、０８０２、０８０３）は１４．２±２．６ｐｇ／
１０９ｖｇで、それよりも小さい（２６２０ｂｐまたは２６３８ｂｐ）のバックボ
ーンを持つベクタープラスミドを用いて作製された５ロット（ロット Ｎ０７０
１、０７０１、０７０２、０７０３、０８０１）で測定された平均値１０７．６
±２７．６ｐｇ／１０ ９ｖｇよりも７．６倍低かった（Ｐ＜０．００１）。そのた
め、ベクター製造用プラスミドに特大のバックボーンを使用することで、プラス
5 ミド由来のＤＮＡ不純物の大幅な削減が達成された。」（１４６頁右欄１７～４
０行）
（１－３）
10 （１４７頁表 １ ）
（１－４）
「今回の研究で、ＡＡＶのパッケージング限界よりも小さいバックボーンを持つ
ベクタープラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入（トランスフェクシ
15 ョン）してＡＡＶベクターを作製したところ、得られたベクターに含まれるヌク
レオチド耐性プラスミドＤＮＡの不純物は２．９～５．７％であり、他者による
過去の報告と一致していた。キャプシド形成するプラスミドＤＮＡの主なソース
は、ＩＴＲを含むベクタープラスミドのバックボーンであった。
・・・
バックボーンがＡＡＶ２のパッケージング容量を超えるようにスタッファー配
列を改変したベクタープラスミドを使用した場合の効果を調べたところ、この戦
5 略により、キャプシド形成したプラスミドＤＮＡ不純物のレベルが大幅に減少す
ることが判明した（７．６倍、Ｐ＜０．００１）。ＡＡＶ２以上のパッケージン
グ容量を持つベクター血清型では、リバースパッケージングを防止するために必
要なバックボーンサイズもそれに応じて大きくなることが予測される。」（１４
９頁右欄下から１０行～１５０頁左欄８行）。
（１－５）
「材料および手法
ＡＡＶの生成と精製。ベクターの生成は、改変した３個のプラスミドを用いた
ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリーの遺伝子導入によって実施した。臨
15 床用ＡＡＶ２－ｈＦＩＸベクターロット１０５３は、２回の塩化セシウム勾配超
遠心法（gradient-only 法）により精製した。本研究では、さらに追加で１４ロッ
トのＡＡＶベクターが製造され、分析が行われた。ヒト凝固第ＩＸ因子（ＡＡＶ
－ｈＦＩＸ）を発現するＡＡＶ２ベクター８ロットとＡＡＶ６ベクター２ロット
は、ＡＡＶのパッケージング限界である約４７００ｎｔを超過する６９８０ｂｐ
20 のバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて作製した。１ロットのＡＡＶ
２、４ロットのＡＡＶ６が２６２０ｂｐまたは２６３８ｂｐのバックボーンを持
つベクタープラスミドを用いて作製された。（１５０頁左欄下から１１～１行）
」