令和3(行ケ)10135審決取消請求事件

令和４年１１月３０日判決言渡

令和３年（行ケ）第１０１３５号 審決取消請求事件

口頭弁論終結日 令和４年９月２８日

判 決

原 告 ザ・チルドレンズ・ホスピタル

・オブ・フィラデルフィア

同訴訟代理人弁護士 笠 継 正 勲

同訴訟代理人弁理士 村 越 智 史

被 告 特 許 庁 長 官

同 指 定 代 理 人 伊 藤 良 子

同 福 井 悟

同 吉 森 晃

同 井 上 千 弥 子

主 文

１ 原告の請求を棄却する。

２ 訴訟費用は原告の負担とする。

３ この判決に対する上告及び上告受理の申立てのための付加期間を３０日

と定める。

事 実 及 び 理 由

第１ 請求

特許庁が不服２０１９－６６６５号事件について令和３年６月２３日にした審決を取り消す。

第２ 事案の概要

１ 特許庁における手続の経緯等（当事者間に争いがない。）

⑴ 原告は、発明の名称を「スタッファー／フィラーポリヌクレオチド配列を含むベクターおよびその使用方法」とする発明について、平成２６年３月１

5 ４日に国際出願（特願２０１６－５０２９３５号。優先日平成２５年３月１５日、優先権主張国米国。以下「本願」という。）をした。原告は、平成３１年１月１７日付けで拒絶査定を受けたため、同年５月２２日付けで拒絶査定不服審判（不服２０１９－６６６５号事件）を請求するとともに、同日付けで特許請求の範囲について手続補正をした。原告は、令和２年９月２日付けで拒絶理由通知を受けたため、令和３年３月３日付けで特許請求の範囲について手続補正をし、また、同月４日付けで特許請求の範囲について手続補正をした（以下、同日付けの補正を「本件補正」という。）が、特許庁は、同年６月２３日、「本件審判の請求は、成り立たない。」との審決（以下「本件審決」という。）をし、その謄本は、同年７月１３日に原告に送達された（附加期間９０日）。原告は、令和３年１１月９日、本件審決の取消しを求める本件訴訟を提起した。２ 特許請求の範囲の記載本件補正後の特許請求の範囲は、請求項１ないし５０からなり、その請求項１及び３０の記載は、次のとおりである（以下、本件補正後の請求項３０に係る発明を「本願発明３０」といい、請求項１に係る発明と併せて「本願発明」ということがある。）。【請求項１】異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノムと、

第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を含ん

でなり、前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し、前記不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたは

5 スタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する組換えベクタープラスミド。【請求項３０】請求項１ないし２７のいずれかの組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子。３ 本件審決の要旨本願発明３０本願発明３０は、本願の請求項１ないし２７を引用する形式で記載されているところ、そのうちの請求項１を引用する部分に係る発明は以下のとおりである。ａ 異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノムと、ｂ 第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を含んでなり、ａ－１ 前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し、ｂ－１ 前記不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子。本件優先日（平成２５年３月１５日）前に日本又は外国において頒布された刊行物（Molecular Therapy. (2009) vol.17, no.1, p.144-152。以下「引用例１」という。）に記載された発明（以下「引用発明」という。）「アンピシリン耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーン、及びヒト凝

5 固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子を有するＩＴＲ含有ベクタープラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして調製された、当該ＩＴＲ含有ベクタープラスミド由来のＤＮＡ不純物が有意に減少した組換えＡＡＶ。」ア 新規性欠如本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」は、本願発明３０における「組換えベクタープラスミド」の、ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に位置し、４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列を含む領域と、当該領域の外側、すなわち、ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プラスミドＤＮＡをごく少量（６０ｐｇ／１０９ｖｇ程度）含む「ベクターゲノム」を含んでなるものである。引用発明に係る「組換えＡＡＶ」は、引用発明における「ＩＴＲ含有ベクタープラスミド」のＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に位置し、「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの遺伝子」を含む領域と、当該二つのＩＴＲ配列の外側に位置する６９８０ｂｐの領域に由来するＤＮＡ不純物を少量含む「ベクターゲノム」を含んでなるものである。ここで、引用発明における「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの遺伝子」は、本願発明３０における「４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列」に相当する。また、引用発明における「ＤＮＡ不純物」は、引用発明における「ＩＴＲ含有ベクタープラスミド」の二つのＩＴＲ配列の外側に位置する６９８０ｂｐの領域に由来するものであるから、本願発明３０における「残存プラスミドＤＮＡ」に相当する。そして、引用例１に記載された「オーバーサイズ（６９８０ｂｐ）のバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製された５つのロット（ロット０６００２、００３Ａ、ＮＨＰ、０８０２、０８０３）」は、ＩＴＲ含有ベクタープラスミド由来のＤＮＡ不

5 純物を１１～１７．７ｐｇ／１０ ９ ｖｇ（平均１４．２±２．６ｐｇ／１０９ｖｇ）含んでいるところ、この数値は、本願明細書で示されている残存プラスミドＤＮＡの量（６０ｐｇ／１０ ９ｖｇ程度）と同等であるから、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」のベクターゲノムに含まれている「ＤＮＡ不純物」、すなわち、「残存プラスミドＤＮＡ」は、本願発明３０と同程度にごく少量であるといえる。そうすると、本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」に含まれている「ベクターゲノム」と、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」に含まれている「ベクターゲノム」とは、いずれも、ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に位置し、４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列を含む領域と、当該二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プラスミドＤＮＡをごく少量含む点で相違ないから、そのような「ベクターゲノム」を含むＡＡＶである、本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」と引用発明に係る「組換えＡＡＶ」との間にも相違はないことになる。したがって、本願発明３０は、引用例１に記載された発明である。イ 進歩性欠如仮に、本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」と、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」との間に差異があったとしても、そのような差異はわずかであるといえ、本願発明３０は、引用発明、引用例１の記載、及び本願優先日当時のＡＡＶに関する周知技術に基づいて、当業者が容易になし得た発明であって、本願の願書に添付した明細書（甲２。以下，図面を含めて「本願明細書」という。）の記載を参酌しても、本願発明３０が奏する効果に顕著な点があるとはいえない。したがって、本願発明３０は、引用発明、引用例１の記載及び本願優先日当時のＡＡＶに関する周知技術に基づいて、当業者が容易になし得た発明である。

5 以上のとおり、本願発明３０は、特許法２９条１項３号及び２項に該当し、特許を受けることができないから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶されるべきものである。４ 取消事由本願発明３０の新規性及び進歩性に係る判断の誤り（引用発明との相違点の看過、一致点の認定の誤り）

第３ 当事者の主張

１

（原告の主張）

相違点（不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ）の看過ア 本願発明３０と引用発明を対比すると、本願発明の組換えベクタープラスミドは、７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を有するのに対し、引用発明のＩＴＲ含有ベクタープラスミドは、６．９８Ｋｂよりも短い不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を有する点で相違する。本件審決には、この点を相違点として認定していない誤りがある。すなわち、本願発明３０に係る請求項３０は、「請求項１のベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子」であるとの発明特定事項を含むものであり、請求項１は「異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノム」との発明特定事項を含むから、本願発明３０のベクターゲノムは、「異種ポリヌクレオチド配列」を含む。また、本願発明３０の「ベクターゲノム」は、異種ポリヌクレオチド配列のほかに微量ではあるが残存ＤＮＡ不純物を含むものであるところ、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量は、組換えベクタープラスミドに含まれるバックボーンの長さによって変わる（【０１７２】、【０１７７】、図５、図６）。そして、本願明細書の【００８３】、図５に記載されているように、第１の不活性

5 のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、ベクタープラスミ

ドのバックボーンに存在するから、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量は、組換えベクタープラスミドに含まれるバックボーン中の第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ（本願発明３０においては７．０ないし１０．０Ｋｂ）によって変わることになる。他方、引用発明の組換えＡＡＶは、アンピシリン耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーンを含むベクタープラスミドをトランスフェクションすることで調製されるものであり、バックボーンのサイズは６９８０ｂｐであるから、そのバックボーン中のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列のサイズは、当然ながら６９８０ｂｐ（６．９８Ｋｂ）よりも短くなる。そうすると、引用発明の組換えＡＡＶは、６９８０ｂｐより短い長さのフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列に応じた量の残存ＤＮＡ不純物を有する。また、後記 のとおり、本願発明３０と引用発明における各ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量の相違は、上記の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さの相違によるものであるといえるから、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さの相違は実質的な相違点であるといえる。したがって、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さの違いが相違点として認定されるべきである。イ これに対して、被告は、後記２ アのとおり、不活性の７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有するフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる構成要素ではない旨主張する。しかし、本願明細書の【０１７２】には、「ベクタープラスミド『バックボーン』ＤＮＡのパッケージングが、ＩＴＲからの『逆転パッケージング』を介してかなりの程度で起こり」との記載があるように、組換えベク

5 タープラスミドのＩＴＲ外側にあるバックボーンは、逆転パッケージング

というメカニズムによりＡＡＶ粒子に残存ＤＮＡ不純物としてパッケージングされる。また、前記アのとおり、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物（残存プラスミドＤＮＡ）の量は、バックボーンの長さに応じて変わるものであり、バックボーンの長さは「不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」の長さによって規定されるものであるから、本願発明３０における「第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」という点は、引用発明との相違点と判断する際にＡＡＶ粒子に残存ＤＮＡ不純物がどの程度含まれるかという観点から考慮されるべき発明特定事項である。したがって、

（被告の主張）

は誤りである。一致点（残存ＤＮＡ不純物量が同程度である。）の認定の誤りア 本件審決は、前記第２の３ アのとおり、本願発明におけるＤＮＡ不純物の含有量とされている６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇと引用発明におけるＤＮＡ不純物の含有量である１４．２±２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇとを比較してＤＮＡ含有量が同程度にごく少量であると結論づけている。しかし、以下のとおり、６．９Ｋｂの長さのサイズ超過バックボーンを用いて調製されたベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物の量の平均が６０ｐｇ／

１０ ９ ｖｇであることを理由にして、このような一致点の認定をするこ

とは誤りである。本願明細書には、７．０ないし１０．０Ｋｂの長さの第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含む組換えベクタープラスミドをパッケージ化したＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量について直接の記載はないものの、本願明細書の図５には、２．５Ｋｂのバックボーンを含むベクタープラスミドがパッケージ化され

5 た比較例としてのＡＡＶベクターのマップ（図５の上側）、７．１Ｋｂ

のバックボーンを有するベクタープラスミドがパッケージ化された実施例２に係るＡＡＶベクターのマップ（図５の下側）が示されており、実施例２に係るＡＡＶに含まれるＤＮＡ不純物の量は、２．５Ｋｂのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶに含まれるＤＮＡ不純物の量の約４０分の１にまで減少することが開示されている。そして、図５には、ＡＡＶ粒子に残存するＤＮＡ不純物の量は記載されていないが、比較例のバックボーンの長さは、引用例１に示されている２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐ（２．６２Ｋｂ又は２．６３８Ｋｂ）と近い２．５Ｋｂであるため、比較例におけるＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量は、引用例１に示されているＤＮＡ不純物の数値（２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶには平均値１０７．６±２７．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇのＤＮＡが含まれていたことが記載されている（別紙２の１－２）。）と同程度のＤＮＡと考えられる。そうすると、７．１Ｋｂのバックボーンを有するベクタープラスミドをパッケージ化された実施例２に係るＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量は、引用例１に示される値の４０分の１である２．６９±０．６９ｐｇ／１０ ９ｖｇ程度であると推定される。また、本願明細書の【０１７７】、図６には、サイズ超過バックボーンを含まないベクタープラスミドを用いて調製されたベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物の平均は、３０１ｐｇ／１０ ９ ｖｇであり、このＤＮＡ不純物の量は、６．９Ｋｂの長さのサイズ超過バックボーンを用いて調製されたベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物の量の平均である６０ｐｇと比較して５倍であったことが開示されているが、図５には、図６で示されている６．９Ｋｂよりも長い７．１Ｋｂの長さのサイズ超過バ

5 ックボーンを用いることで残存ＤＮＡ不純物の量が１／４０減少するこ

とが記載されているから、本願明細書の記載により、サイズ超過バックボーンの長さを長くすることで残存ＤＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなると当業者は理解することができる。そして、本願発明３０の組換えベクタープラスミドは、７．０ないし１０．０Ｋｂの長さの第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含むから、バックボーンの長さは７．１Ｋｂを超えるものであり、７．１Ｋｂよりも長いバックボーンを含む組換えベクタープラスミドをパッケージ化した本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の減少割合は、実施例２で説明される１／４０よりも大きいと理解できる。したがって、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量は、２．６９±０．６９ｐｇ／１０ ９ ｖｇよりも更に少なくなると理解することができる。他方、引用文献１には、６９８０ｂｐのバックボーンを有するベクタープラスミド（ロット ０６００２、００３Ａ、ＮＨＰ、０８０２、０８０３）で測定された平均残留プラスミドＤＮＡレベルは、１４．２±２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇであったことが記載されている（別紙２の１－２）。以上を前提として、本願発明３０と引用発明とを対比すると、引用発明のＡＡＶ粒子には、１４．２±２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇ程度のＤＮＡ不純物が含まれるのに対し、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量は、２．６９±０．６９ｐｇ／１０ ９ ｖｇ程度かそれよりも少なく、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量と引用発明の組換えＡＡＶに含まれる残存ＤＮＡ不純物の量は相違している。本願発明３０の組換えベクタープラスミドは７．０ないし１０．０Ｋｂの長さの第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド

5 配列を有しており、本願明細書の【０１７７】に記載されている６．９

Ｋｂの長さのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製したＡＡＶ粒子は本願発明３０の技術的範囲外であるから、６．９Ｋｂの長さのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量である６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇと、引用発明におけるＤＮＡ不純物の含有量を比較して同程度にごく少量であると結論付けた本件審決の判断は、その前提において誤りがある。イ これに対して、被告は、後記２ ア のとおり、本願明細書には、本願発明３０の実施例は記載されておらず、加えて、ＤＮＡ不純物の量は、同じバックボーンでもバッチによって差異が生じるから、本願発明３０のＡＡＶ粒子が有するＤＮＡ不純物の量を具体的に特定することも引用発明との間に差異を見出すこともできない旨主張する。確かに、本願明細書には、第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する組換えベクタープラスミドを用いて調製したＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物を定量化したデータは含まれていないが、前記ア のとおり、引用例１には、本願明細書の図５で比較例とされている２．５Ｋｂのバックボーンと近い長さを有する２．６２Ｋｂ又は２．６３８Ｋｂの長さのバックボーンの長さを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＤＮＡ不純物の量の平均値が記載されているから、図５の実施例２（バックボーンの長さが７．１Ｋｂの場合）におけるＤＮＡ不純物の量は推定できる。また、同じバックボーンサイズでも実験条件によってＤＮＡ不純物の量に差異が生じるが、バックボーンサイズで得られた複数のＤＮＡ不純物の量の平均値を用いて比較を行えば問題はなく、

（被告の主張）

は理由がない。

5 被告は、後記２ イのとおり、本願明細書の図５には、ＤＮＡ不純物

の量が約４０分の１になるとの結論を導いた実験条件や元データの詳細は記載されておらず、「約４０分の１」という数字には根拠がない旨主張する。しかし、本願明細書の実施例（【０１６１】ないし【０１７７】）では、分子生物学の分野での標準的な手法に従ってＤＮＡ不純物の量を定量している。本願明細書の図５には具体的な実験データは記載されていないが、当業者は、実施例３（【０１７３】ないし【０１７７】）に関して明記されているＡＡＶ粒子の産生方法やＤＮＡ不純物の定量方法を参照し、図５に示されている結果はこれと同様の標準的な手法に従って定量されたＤＮＡ不純物の量に基づいて減少幅を１／４０と評価していると理解できるのであるから、

（被告の主張）

は理由がない。小括以上のとおり、本件審決には、前記 のとおり、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さに係る実質的な相違点を看過した誤り、及び前記 のとおり、残存ＤＮＡ不純物量が同程度であるとした一致点に関する認定の誤りがあるから、このような誤った相違点及び一致点を前提にしてされた新規性及び進歩性の判断も誤りである。２

（被告の主張）

相違点（不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ）の看過の主張についてＡＡＶベクターは、「２つのＩＴＲ配列及びその間に目的の遺伝子（治療遺伝子）が挟まれたゲノム」を含むものであり、上記ゲノムとバックボーンを含むベクタープラスミドそのものを丸ごと含むものではないから、ＩＴＲ外側のバックボーン配列は、実質的にはＡＡＶベクターに含まれないものである。そうすると、引用発明のＡＡＶベクターゲノムである「組換えＡＡＶ」

5 においてパッケージングされている「ベクターゲノム」は、「アンピシリン

耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーン、及びヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子を有するＩＴＲ含有ベクタープラスミド」のうち、「アンピシリン耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーン」を除いたものであり、２つのＩＴＲとその間に挟まれた目的遺伝子である「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子」であることは当業者に明らかである。他方、本願発明３０の「ＡＡＶ粒子」に含まれている「ベクターゲノム」は、「二つのＩＴＲ配列」及びその「内側に位置し」「４．７Ｋｂを下回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」である。そして、引用発明の「ヒト凝固第Ⅸ因子」は本願発明３０の「異種ポリヌクレオチド配列」に相当し、引用発明の「４２９７ｎｔ」は本願発明３０の「４．７Ｋｂを下回る長さ」に相当する。そうすると、引用発明の「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子を有するＩＴＲ」は、本願発明の「二つのＩＴＲ配列」とその「内側に位置し」「４．７Ｋｂを下回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」である「ベクターゲノム」に相当するから、本願発明と引用発明は、「二つのＩＴＲ配列」とその「内側に位置し」「４．７Ｋｂを下回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」である「ベクターゲノム」を含む観点において、構成要素が相違しない。一致点（残存ＤＮＡ不純物量が同程度である。）の認定の誤りの主張についてア 本願明細書の【００３５】の記載から、本願発明３０の課題は、残存ＤＮＡ不純物量を少なくするか、又はこれを含まない組換えＡＡＶ粒子の提供にあるといえる。これに対して、引用例１には、ＤＮＡ不純物を最小限に抑えることが記載され（別紙２の１－１）、「ベクタープラス

5 ミドのバックボーンサイズがＤＮＡの不純物レベルに与える影響」 「ベ

、クタープラスミドのバックボーンサイズが、組換えＡＡＶ２及びＡＡＶ６に残留するプラスミドＤＮＡ不純物の量に及ぼす影響が評価された。 、」「ベクター製造用プラスミドに特大のバックボーンを使用することで、プラスミド由来のＤＮＡ不純物の大幅な削減が達成された」（別紙２の１－２）との記載があるから、引用発明の解決しようとする課題も、組換えＡＡＶにおけるＤＮＡ不純物量を最小限に抑えることであるといえる。そうすると、本願発明３０と引用発明は、ＤＮＡ不純物を減少させるという同じ課題を有するものである。本願明細書の【０１７１】、図１によると、ＡＡＶ粒子に含まれる残存プラスミドＤＮＡは、導入遺伝子カセットサイズが２．７Ｋｂでは１６４ｐｇ／１０ ９ｖｇ、サイズが３．７Ｋｂでは４２．７ｐｇ／１０ ９ｖｇ、サイズが４．３Ｋｂでは１４．０ｐｇ／１０ ９ｖｇであることが記載されており、導入遺伝子カセットサイズがパッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）に近づくにつれてＤＮＡ不純物が減少することが理解できるから、本願明細書には、パッケージング許容限界サイズに近い導入遺伝子カセットサイズを採用すると、導入遺伝子カセットサイズの長さに応じてＤＮＡ不純物が減少することが開示されているといえる。そして、前記 のとおり、本願発明と引用発明は、「４．７Ｋｂを下回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」を有する「ベクターゲノム」を含む点で共通するから、導入遺伝子カセットサイズにより生じる「ＤＮＡ不純物」の量において実質的な差異はない。また、本願明細書の【０１７２】、図５には、ベクタープラスミド「バックボーン」ＤＮＡのパッケージングがＩＴＲからの「逆転パッケージング」を介してかなりの程度で起こり、それはサイズ超過（＞４．７Ｋｂ）のバックボーンを用いることで大幅に減少すること、サイズ超過バ

5 ックボーンを用いると残存プラスミドＤＮＡは約４０分の１（０．１～

１．０％）に減少することが記載されており、これを具体的に裏付けるものとして、本願明細書の【０１７７】、図６には、サイズ超過バックボーンを含まないベクタープラスミドを用いて調製されたベクター（ＡＡＶ粒子）中の１０ ９ ｖｇ（ベクターゲノム）当たりのプラスミドＤＮＡ不純物の平均は３０１ｐｇであるのに対し、サイズ超過のバックボーンを用いて調製された１０ ９ｖｇ（ベクターゲノム）当たりのプラスミドＤＮＡ不純物の平均は６０ｐｇであることが記載されている。このように、本願明細書には、ベクタープラスミド内のサイズ超過バックボーンを用いることにより、ウイルスベクター（ＡＡＶ粒子）中のＤＮＡ不純物が大きく低減することが記載されているから、ベクタープラスミドのバックボーンサイズがサイズ超過である本願発明の「ＡＡＶ粒子」は、ＤＮＡ不純物が大幅に減少しているといえる。これに対し、引用文献には、バックボーンが組換えＡＡＶ２のパッケージング容量を超えるように改変した特大のバックボーンを持つプラスミドでは、プラスミドＤＮＡ不純物のレベルが大幅に減少することが記載されている（別紙２の１－２、１－４）から、引用発明の「組換えＡＡＶ」もＤＮＡ不純物が大幅に減少しているといえる。したがって、本願発明と引用発明は、サイズ超過（＞４．７Ｋｂ）のバックボーンを用いるものであり、大幅に減少し、ごく少量のＤＮＡ不純物を有する点で一致する。なお、本願明細書の図５には、「ＡＡＶのパッケージング許容限界を超えるサイズ超過プラスミドバックボーン（７．１Ｋｂ）は、非ベクターＤＮＡのパッケージングを著しく低下させる。」と記載され、図５の下の図における「ＤＮＡ Ｓｔｕｆｆｅｒ」が本願発明でいうところの「第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」

5 に対応するが、「ＤＮＡ Ｓｔｕｆｆｅｒ」の長さは「バックボーン７．

１Ｋｂ」よりも大幅に短いことは図面上明らかである。そうすると、図５には、「第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなる本願発明３０のＡＡＶ粒子が記載されているとはいえず、その他、本願明細書には、本願発明３０のＡＡＶ粒子を具体的に裏付ける実施例の記載はない。加えて、本願明細書の図６によると、ＤＮＡ不純物の量は、同じサイズ超過バックボーンを採用したとしても、バッチ（実験条件）によって差異が生じることが読み取れるから、本願発明３０のＡＡＶ粒子が有するＤＮＡ不純物の量を具体的に特定することも、引用発明との間に差異を見出すこともできない。以上のとおり、本願発明と引用発明は、「大幅に減少」し、「ごく少量」のＤＮＡ不純物を有する点で一致し、ＤＮＡ不純物の量について差異はなく、「ＤＮＡ不純物」の観点で相違するものではない。なお、本件審決は、前記第２の３ アのとおり、本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」は、「ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プラスミドＤＮＡをごく少量（６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇ程度） 「ベクターゲノム」含む を含んでなるもの」と認定し、「ごく少量」、「程度」の文言を用いており、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量が６．９Ｋｂの長さを有するベクタープラスミドを用いて調製したＡＡＶ粒子の場合と同じ６０ｐｇ／１０ ９ ｖｇであるとまでは認定していない。イ これに対して、原告は、前記１ アのとおり、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量が組換えベクタープラスミドに含まれるバックボーンの長さによって変わるものであり、本願明細書の図５、図６によれば、

5 当業者は、サイズ超過バックボーンの長さを長くすることにより、残存Ｄ

ＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなることを理解することができる旨主張する。しかし、本願明細書には、サイズ超過のバックボーンを用いると残存ＤＮＡ不純物の量が大きく減少することが記載されているにすぎず、４．７Ｋｂを超えるバックボーン同士で比較した場合において、バックボーンの長さを長くすればするほどＤＮＡ不純物の量が減少することは記載されていない。前記ア のとおり、本願明細書には、本願発明３０のＡＡＶ粒子を具体的に裏付ける実施例の記載はなく、「７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」配列は好ましい範囲として記載されていたものでもない。そうすると、パッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）を超える範囲で「フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」の長さを「７．０ないし１０．０Ｋｂ」の範囲に調整することでＤＮＡ不純物の量が減少することが本願明細書に説明されているとはいえない。加えて、本願明細書の図５には、ＤＮＡ不純物の量が約４０分の１になるとの記載があるが、実験条件及び元データ詳細の記載はなく、図５の「１／４０」と図６の「１／５」の数値の違いが、バックボーンの長さの差である０．２Ｋｂ（７．１Ｋｂ－６．９Ｋｂ）のみに起因するとはと考えられない。そうすると、本願明細書には、バックボーンの長さ又はバックボーンの一部である「フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」を長くすればするほど、残存ＤＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなることは記載されているとはいえず、

（原告の主張）

は本願明細書の記載に基づくものではない。小括以上によれば、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」のベクターゲノムに含ま

5 れる残存ＤＮＡ不純物、すなわち、残存プラスミドＤＮＡは、本願発明３０

と同程度にごく少量であり、本願発明３０に係るＡＡＶ粒子に含まれているベクターゲノムと、引用発明に係る「組換えＡＡＶ」に含まれている「ベクターゲノム」とは、いずれもＡＡＶの二つのＩＴＲ配列と、その内側に位置し、４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列を含む領域と、当該二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プラスミドＤＮＡをごく少量含む点で相違ないから、そのような「ベクターゲノム」を含むＡＡＶである本願発明３０に係る「ＡＡＶ粒子」と引用発明に係る「組換えＡＡＶ」との間には相違点は存在しない旨の本件審決の判断に誤りはなく、原告主張の取消事由は理由がない。

第４ 当裁判所の判断

１ 本願明細書の記載事項について本願明細書（甲２）には、別紙１のとおりの記載があり、この記載事項によれば、本願明細書の発明の詳細な説明には、本願発明３０に関して、次のとおりの事項が開示されていると認められる。ア 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ベクター中に存在するＤＮＡ不純物の除去のためにヌクレアーゼ処理を行ってもＤＮＡ断片がパッケージされるなどの問題があった（【０００２】）。ＡＡＶ内のカプシド化した残存ＤＮＡの多くは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含むベクタープラスミドテンプレートに由来する（【０００３】）。本願の発明者らは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）より短いベクター発現カセットを含むｒＡＡＶベクタープラスミドでは残留プラスミドＤＮＡ不純物レベルが上昇し、配列がｒＡＡＶの本来のパッケージング許容限界サイズより短いほど不純物のレベルが上昇したことを明らかにした（【００３４】）。

5 本願発明は、ウイルス（ＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズの配列を有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド及び該組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドを、例えば、残存ＤＮＡ不純物量を少なくしたか、又はこれを含まない組換えウイルス粒子を作成するために用いる方法を提供するものであり、例えば、ベクターゲノム配列のサイズを最適化することで、抗生物質抵抗性を生じる細菌遺伝子のような望ましくない核酸配列のベクターを介した導入に関わる潜在的危険性を軽減することができる（【００３５】）。イ 本願発明の組換えベクタープラスミドは、ＡＡＶ等のウイルスの野生型ゲノムに由来し、分子学的手法を用いてウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを取り除き、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療的遺伝子発現カセット）のような外来の核酸で置換したものであり、「ベクターゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージ又はカプシド化される異種ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクタープラスミドの一部を指すものである（【００４０】、【００８０】）。ウ 本願発明の組換えベクタープラスミドは、パッケージ又はカプシド化されて感染能力のあるウイルス粒子を形成するウイルスゲノム配列の正常なサイズ、又はそれに近いサイズに長さを変更又は調節する追加的なフィラー／スタッファー核酸配列を含むものであり、種々の実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパクをコードしない）断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）である。ＡＡＶベクターの特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、その長さが４．７Ｋｂ未満であり、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列と合わせた（例えばベクター内に挿入された）時の全長が約３．０Ｋｂ～５．５Ｋｂ、４．０～５．０Ｋｂ、４．３～４．８Ｋｂである。（【００８２】）

5 エ 図４は、短い導入遺伝子カセットを含むベクター内のプラスミドＤＮＡのカプシド化を示す略図である（【００３１】）。次に、本願明細書の発明の詳細な説明には、実施例として、次の開示がある。ア 実施例１カプシド化されたＤＮＡのサイズは、短い導入遺伝子カセット（２７１６ｂｐ）を有するベクターと長い導入遺伝子カセット（４２９７ｂｐ）を有するカセットとで同等であり、ＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）にほぼ対応し、短い導入遺伝子カセットを有するベクター内にパッケージされたＤＮＡは、ゲノムに隣接するプラスミド配列を含むことが示された（【０１６４】、【０１６６】、図２Ｂ、図２Ｄ）。イ 実施例２導入遺伝子プラスミドのバックボーン内の導入遺伝子カセットの５’ＩＴＲの近傍に位置するＫａｎＲ又はＡｍｐＲ遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用いて測定された残存プラスミドＤＮＡのレベルを、２．

5 ７Ｋｂ、３．７Ｋｂ（当審注：図１には「３．９Ｋｂ」とあるが「３．７Ｋｂ」の誤記と認める。）、４．３Ｋｂのサイズの一本鎖標準導入遺伝子発現カセットを含むＡＡＶ２ベクターにおいて評価した結果、ｒＡＡＶＡ（サイズは２．７Ｋｂ）は１６４ｐｇ／１０ ９ ｖｇ、ｒＡＡＶ Ｂ（サイズは３．７Ｋｂ）は４２．７ｐｇ／１０ ９ｖｇ、ｒＡＡＶ Ｃ（サイズは４．３Ｋｂ）は１４．０ｐｇ／１０ ９ ｖｇの残存プラスミドＤＮＡをそれぞれ含むことが示された（【０１６８】ないし【０１７１】、図１）。また、ベクタープラスミド「バックボーン」ＤＮＡのパッケージングが、ＩＴＲからの「逆転パッケージング」を介してかなりの程度で起こり、サイズ超過（＞４．７Ｋｂ）（当審注：【０１７２】には「＞４．７ｂｐ」とあるが「＞４．７Ｋｂ」の誤記と認める。）のバックボーンを用いることで大幅に減少する（【０１７２】、図５）。ウ 実施例３サイズ超過バックボーンを用いずに調製されたベクターのＤＮＡ不純物と、サイズ超過バックボーンを用いて調製したベクターのＤＮＡ不純物

5 を比較した結果、ベクタープラスミドバックボーンが３．８Ｋｂの長さの場合は平均で３０１ｐｇ／１０ ９ ｖｇであったのに対して、ベクタープラスミドバックボーンが６．９Ｋｂの長さの場合は平均で６０ｐｇ／１０ ９ｖｇであり、ベクタープラスミド内のサイズ超過バックボーンは、ウイルスベクターの調製において不純物の低減に使用することができる（【０１７３】ないし【０１７７】、図６）。前記 及び の本願明細書の開示事項によれば、本願発明３０は、残存ＤＮＡ不純物の量を少なくし、又はこれを含まない組換えＡＡＶ粒子を提供することをその課題とするものであり（前記 ア）、４．７Ｋｂを下回る長さの異種ポリヌクレオチド配列（ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列の内側に位置するもの）と、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含んだベクタープラスミドを用いて、上記課題を解決する（【０１６６】、図１、図２及び図４。なお、この点については後記３ エで詳述する。）ものであると認められる。

２ 引用例１の記載事項について引用例１には、別紙２のとおりの記載（ただし、訳文は乙１による。）が

5 あり、この記載事項によれば、次のとおりの事項が開示されていると認められる。ア これまでの研究で、キャプシド形成するプラスミドＤＮＡ不純物は、主にＩＴＲ含有ベクター製造用プラスミドのバックボーンに由来するものであることが報告されているところ、組換えＡＡＶ２及びＡＡＶ６に残留するプラスミドＤＮＡ不純物量に対するベクタープラスミドのバックボーンサイズの影響を評価した（別紙２の１－２）。ヒト凝固第Ⅸ因子を発現するＡＡＶ２ベクター８ロットとＡＡＶ６ベクター２ロットは、ＡＡＶのパッケージング限界である約４７００ｎｔを超過する６９８０ｂｐのバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて作製し、比較対象として、１ロットのＡＡＶ２と４ロットのＡＡＶ６ベクターが、２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐのバックボーンを持つベクタープラスミドを用いて作製された（別紙２の１－３、１－５）。イ 残留プラスミドＤＮＡのレベルは、ベクター生成に使用した３つの産生プラスミドに共通する配列であるＡｍｐ Ｒ（アンピシリン耐性遺伝子）に特異的なプライマーとプローブを用いたＱ－ＰＣＲで測定した結果、特大（６９８０ｂｐ）のバックボーンを持つベクタープラスミドを用いて作製された５ロットで測定された平均残留プラスミドＤＮＡレベルは１４．２±２．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇであり、より小さい（２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐ）バックボーンを持つベクタープラスミドを用いて作製された５ロットで測定された平均値１０７．６±２７．６ｐｇ／１０ ９ ｖｇよりも７．６倍低く、ベクター製造用プラスミドに特大のバックボーンを使用することで、プラスミド由来のＤＮＡ不純物の大幅な削減が達成された（別紙２の１－２、１－３（表１））。ウ 今回の研究では、ＡＡＶのパッケージング限界よりも小さいバックボーンを持つベクタープラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入（ト

5 ランスフェクション）してＡＡＶベクターを作製したところ、得られたベクターに含まれるヌクレオチド耐性プラスミドＤＮＡの不純物は２．９～５．７％であった。バックボーンがＡＡＶ２のパッケージング容量を超えるようにスタッファー配列を改変したベクタープラスミドを使用した場合の効果を調べると、キャプシド形成したプラスミドＤＮＡ不純物のレベルが大幅に減少することが判明した（７．６倍）。（別紙２の１－４）。前記 の開示事項によると、引用例１には、本件審決が認定した引用発明（前記第２の３ ）が記載されていると認められる。

３ 取消事由（本願発明３０の新規性及び進歩性に係る判断の誤り（引用発明との相違点の看過、一致点の認定の誤り））について本願発明３０の技術的意義についてア 原告は、前記第３の１ のとおり、本願発明３０と引用発明を対比すると、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さが相違し、かつ本願発明３０と引用発明における各ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量の相違は、この長さの相違によるものであるといえるから、この長さの相違は実質的な相違点であるといえる旨主張するので、まず、本願発明３０の技術的意義について検討する。イ 本願発明３０に係る請求項３０は、請求項１ないし２７の「組換えベクタープラスミド」を引用する形式で記載されている。このうち請求項１で引用する部分に係る発明（本願発明３０）は、次のとおり特定される（下線部は当審で付した。）。「異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターゲノムと、

第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を

含んでなり、前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつ、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し ①、前記

5 不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する ② 組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子」ウ 前記イのとおり、本願発明３０は、「フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」との構成を有するところ、引用発明においては、この点に関する記載がないことは明らかである。原告は、前示のとおり、本願発明３０と引用発明の相違は、この長さの相違によるものであるといえるから、この長さの相違は実質的な相違点である旨主張しているので、以下、この点について検討する。本願発明３０は、下線部①と②で構成される組換えベクタープラスミドのベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子であり、組換えベクタープラスミド自体を含んでなるとは構成されていない。ＡＡＶ粒子は、一般的に二つのＩＴＲの間に目的の導入遺伝子を挿入したベクタープラスミド、ＡＡＶヘルパープラスミド、アデノウィルスヘルパープラスミドの３種類のプラスミドベクターを２９３細胞にトランスフェクションし、二つのＩＴＲの間にある導入遺伝子がＡＡＶ内にカプシド化されるものである（乙５の図３）から、本願発明３０の「ベクターゲノムを含んでなるＡＡＶ粒子」とは、本願明細書の図４も参照すると、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲの内側に位置する４．７Ｋｂを下回る長さを有する異種ポリヌクレオチド配列（下線部①の構成）を含むものであるとはいえるものの、下線部②の構成に係るフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含むものであるとまでは当然にはいえない。被告は、この点を重視して、前記第３の２ のとおり、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ粒子）は、「２つのＩＴＲ配列及びその間に目的の遺伝子（治療遺伝子）が挟まれたゲノム」を

5 含むものであり、上記ゲノムとバックボーンを含むベクタープラスミドそのものを丸ごと含むものではないから、ＩＴＲ外側のバックボーン配列は、実質的にはＡＡＶベクターに含まれないものであるとし、本願発明と引用発明は、「二つのＩＴＲ配列」とその「内側に位置し」「４．７Ｋｂを下回る長さを有」する「異種ポリヌクレオチド配列」である「ベクターゲノム」を含む観点において、構成要素が相違しない旨主張する。しかし、本件審決は、前記第２の３ アのとおり、ベクターゲノムは異種ポリヌクレオチド配列を含む領域にとどまらず、当該領域の外側、すなわち、ＡＡＶの二つのＩＴＲ配列の外側に位置する領域に由来する残存プラスミドＤＮＡをごく少量含むものと認定しているところであり、ベクターゲノムがＩＴＲ外側のバックボーン配列を一部なりとも含む可能性は否定し難いし、いずれにしても本願発明３０の技術的意義が下線部①の構成に限られず、下線部②の構成にも存在するのであれば、本件発明３０の構成要素として下線部①の構成のみを取り上げるのは相当とはいえないから、さらに、本願発明３０の技術的意義について検討する。エ 本願明細書には、「ここに開示される研究は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズ（約４．７ｋｂ）より短いベクター発現カセットを含むｒＡＡＶベクタープラスミドでは、残留プラスミドＤＮＡ不純物のレベルが上昇したこと、および配列がｒＡＡＶ本来のパッケージング許容限界サイズより短いほど不純物のレベルが上昇したことを示す。・・・」（【００３４】）との記載があり、また、図２には、短い導入遺伝子カセット（２．７Ｋｂ）と長い導入遺伝子カセット（４．３Ｋｂ。【０１６４】には「４．２ｋｂ」とあるが図２には「４２９７ｂｐ」とあるので「４．３Ｋｂ」の誤記と認める。 を含むベクタープラスミドをパッケージングした実験結果 【０） （１６４】）と共に、「カプシド化されたＤＮＡのサイズ（例えばベクタ

5 ーゲノムサイズと併せたＤＮａｓｅ耐性プラスミドバックボーンＤＮＡ）は、短いゲノムを有するベクターと長いゲノムを有するベクターとで同等であり、ＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）（当審注：【００３４】等の記載から４．７Ｋｂの誤記であると認める。）にほぼ対応した。短いゲノムを有するベクター内にパッケージされたＤＮＡは、ゲノムに隣接するプラスミド配列を含み、短いゲノムを有するベクターは、ＡＡＶウイルスの最大パッケージング許容限界までのサイズのプラスミド配列をパッケージすることが示された」 【０１６６】（ ）との記載がある。さらに、図４には、ＡＡＶ粒子のパッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）の導入遺伝子カセットの長さがＡＡＶ粒子のパッケージング許容限界サイズ（約４．７Ｋｂ）であるときと比較して、導入遺伝子カセットが短い（＜４．７Ｋｂ）場合には、ＤＮａｓｅに抵抗性のプラスミドＤＮＡ断片もカプシド化されることを表す略図が開示されていることに加え、前記１ イの実施例２の開示事項を総合すると、異種ポリヌクレオチドをベクタープラスミドを用いてカプシド化したＡＡＶ粒子には、導入遺伝子（異種ポリヌクレオチド）に隣接するプラスミド配列もパッケージング許容限界サイズ（４．７Ｋｂ）までパッケージングされること、導入遺伝子がパッケージング許容限界サイズより短いサイズであればあるほど、精製されたＡＡＶベクター（ＡＡＶ粒子）に含まれるプラスミドＤＮＡ不純物の量が増えるものと理解することができる。また、本願明細書には、「ある態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は不活性または無害であり、機能や活性を有しない。・・・フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はタンパク質やペプチドをコードする配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は異種ポリヌクレオチド配列、ＡＡＶ逆方向

5 末端反復配列（ＩＴＲ）、発現制御要素、複製起点、選択マーカーまたはポリアデニン（ｐｏｌｙ－Ａ）配列のいずれとも異なる配列である」（【００１２】）、「ここで定義される組換えベクタープラスミドは、パッケージまたはカプシド化されて感染能力のあるウイルス粒子を形成するウイルスゲノム配列の正常なサイズ、またはそれに近いサイズに長さを変更または調節する、追加的なフィラー／スタッファー核酸配列を含む。種々の実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパクをコードしない） （ｓｅｇｍｅｎｔ）断片 である。・ 」・・（【００８２】）、「・・・別の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側ＩＴＲ配列に隣接して配置されるものとする。 ・ （・ ・」 【０００７】）との記載があり、これらの記載を総合すると、ＩＴＲ外側の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、残存プラスミドＤＮＡと評価される組換えプラスミドベクターの配列がパッケージ又はカプシド化されることを防止するために挿入される、機能や活性を有しない核酸の断片であると理解することができる。前記 で指摘した本願明細書で開示されている事項を総合すると、前記１ のとおり、本願発明３０は、残存ＤＮＡ不純物の量を少なくし、又はこれを含まない組換えＡＡＶ粒子を提供することがその課題であると認められるところ、本願発明３０の技術的意義は、ＡＡＶ粒子を、二つのＩＴＲの内側に位置する異種ポリヌクレオチド配列の長さがＡＡＶ粒子のパッケージング許容限界（約４．７Ｋｂ）を下回るときに、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチドを、導入遺伝子である異種ポリヌクレオチド配列と合わせた長さが少なくともパッケージング許容限界を超えるように調製されたベクタープラスミドのベク

5 ターゲノムを含むものとすることで、プラスミドに由来する残存ＤＮＡ不純物の量を減らし，上記の課題を解決することにあるものと理解できる。オ 原告は、前記第３の１ のとおり、ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量は、組換えベクタープラスミドに含まれるバックボーン中の第１の不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さ（本願発明３０においては７．０ないし１０．０Ｋｂ）によって変わることになる旨主張するところ、本願明細書には、「不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」構成（下線部②の構成）に調製したベクタープラスミドを用いて作製されたＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物を示す実施例の開示はない。もっとも、本願明細書には、サイズ超過（ＡＡＶ粒子のパッケージング許容限界の超過を意味するものと解される。）のバックボーン（７．１Ｋｂ）を有するベクタープラスミドを用いると残存プラスミドＤＮＡ不純物の量は約４０分の１（０．１～１．０％）に減少すること（図５）、サイズ超過バックボーン６．９Ｋｂを有するベクタープラスミドを用いると、サイズ超過していないバックボーン（３．８Ｋｂ）を有するベクタープラスミドを用いた場合と比較して、ＤＮＡ不純物の量が約５分の１まで低減したこと（実施例３）が開示されており、ここでいう「バックボーン」とは、ベクタープラスミドにおける二つのＩＴＲ配列の外側の領域であり、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が含まれるものであると解される（本願明細書の図５も、ベクタープラスミドのうち、導入遺伝子が内側に位置する二つのＩＴＲの外側にある部分をバックボーンと記載している。）。

5 他方、本願明細書には、図５の上段と下段ではベクタープラスミドに含まれる導入遺伝子の長さは異なるものと認められるものの、具体的な長さについては記載がなく、また、図６にも，３．８Ｋｂと６．９Ｋｂのバックボーンサイズのベクタープラスミドに含まれる導入遺伝子の長さについての記載はない。また、前記１ ア、同 ア、イ、図１及び図４の各開示事項によれば、本願明細書には、パッケージング許容限界サイズ（４．７Ｋｂ）により近い導入遺伝子カセットを採用するとＤＮＡ不純物の量が減少し、許容限界サイズより短いほどＤＮＡ不純物の量が上昇したことが開示されているのにとどまるから、導入遺伝子の長さに関係なく、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチドを含むバックボーンの長さを長くすればするほどＤＮＡ不純物の量が著しく減るものと理解することはできない。そうすると、前記図５や実施例３においてＤＮＡ不純物の量が減少したと記載されていても、これをもって直ちに、この減少がフィラー又はスタッファーポリヌクレオチドを含むバックボーンが長いことによるものと理解することはできず、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有すること（下線部②）は、その長さそれ自体に独自の技術的意義を見出すことはできないが、前記エ の技術的意義に照らし課題の解決に資する長さを構成するという限度では有意であると理解すべきである。カ 以上によれば、本願発明３０の構成要素として下線部①の構成のみを取り上げるのは相当とはいえず、本願発明３０の「ＡＡＶ粒子」には、下線部②の構成がそのままパッケージ化されるものではないとしても、この構成を含めて、引用発明との対比をすべきであるから、この点においては、本件審決の判断には誤りがある。本願発明３０と引用発明との対比について

5 ア 原告は、本願発明３０の下線部②の構成が本願発明３０と引用発明の実質的な相違点であると主張するので、以下、前記 における認定を前提にして、本願発明３０と引用発明との対比を行う。前記 イのとおり、本願発明３０は、「前記異種ポリヌクレオチド配列が４．７Ｋｂを下回る長さを有し、かつ、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の内側に位置し」との構成を有する。これに対して、引用発明は、「ヒト凝固第Ⅸ因子をコードする４２９７ｎｔの導入遺伝子を有するＩＴＲ含有」のベクタープラスミドの構成を有するものであるところ、本願発明３０の「異種ポリヌクレオチド」は、引用発明の「ヒト凝固第Ⅸ因子」に相当し、ともに「４．７Ｋｂ」を下回るベクタープラスミドを含む点で共通する。イ 次に、本願発明３０は、「前記不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の二つのＩＴＲ配列の外側に位置し、該第１の不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列が７．０ないし１０．０Ｋｂの長さを有する」構成を有する。これに対して、引用発明は、「アンピシリン耐性遺伝子を含む６９８０ｂｐのバックボーン」のベクタープラスミドの構成を有するものである。そして、引用例１には、「ヒト凝固第Ⅸ因子（ＡＡＶ－ｈＦＩＸ）を発現するＡＡＶ２ベクター８ロットとＡＡＶ６ベクター２ロットは、ＡＡＶのパッケージング限界である約４７００ｎｔを超過する６９８０ｂｐのバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて作製した。」（別紙２の１－５）、「バックボーンがＡＡＶ２のパッケージング容量を超えるようにスタッファー配列を改変したベクタープラスミドを使用した場合の効果を調べたところ、この戦略により、キャプシド形成したプラスミドＤＮＡ不純物のレベルが大幅に減少することが判明した（７．６倍、Ｐ＜０．００１）」（別紙２の１－４）との各記載があるから、引用発明は、バック

5 ボーンがＡＡＶのパッケージング許容限界を超えるようにスタッファー配列を改変したベクタープラスミドを使用することで、ＡＡＶ粒子に含まれるプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量を減少させるという課題を解決した発明であると理解することができる。そうすると、本願発明３０と引用発明では、導入遺伝子とスタッファーポリヌクレオチド配列を含むベクタープラスミドを用いて調製したときのＡＡＶ粒子に含まれるプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量を減少させるという課題の共通性があり、また、前記アのとおり、導入遺伝子がいずれもパッケージング許容限界である４．７Ｋｂを下回るものであるが、ベクタープラスミドの不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さにおいて相違する。しかしながら、本願発明３０においては、ベクタープラスミドのフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さが「７．０ないし１０．０Ｋｂの長さ」という特定の範囲の長さであることには技術的意義がなく、ＡＡＶ粒子を、導入遺伝子の長さがＡＡＶ粒子のパッケージング許容限界（約４．７Ｋｂ）を下回るときに、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチドを導入遺伝子である異種ポリヌクレオチド配列の長さと合わせて少なくともパッケージング許容限界の長さを超えるように調製されたベクタープラスミドのベクターゲノムを含むものとすることにその技術的意義があると理解できることは、前記 エ のとおりである。そうすると、引用発明においても、バックボーンがＡＡＶのパッケージング許容限界を超えるようにスタッファー配列を改変するものであり、導入遺伝子の長さ（４２９７ｎｔ（約４．２９７Ｋｂ））とこのバックボーン（６９８０ｂｐ（約６．９８０Ｋｂ））に含まれるスタッファー配列の長さが少なくともパッケージング許容限界である４．７Ｋｂを上回るものと理解できるから、本願発明３０と引用発明とは、その技術的意義において同一

5 であり、本願発明３０において、ベクタープラスミドのフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さを「７．０ないし１０．０Ｋｂの長さ」という特定の範囲の長さにしたことは実質的な相違点とはいえない。加えて、引用発明の「６９８０ｂｐのバックボーン」は「サイズ超過バックボーン」（【０１７３】ないし【０１７７】参照）であるところ、前記オのとおり、本願明細書の記載からは、本願発明３０の「７．０ないし１０．０Ｋｂの長さ」を有する「不活性のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列」は、サイズ超過バックボーンを構成するものと理解できるにすぎないから、この観点においても、両者が相違するものとはいえない。原告の主張についてア 原告は、前記第３の１ ア のとおり、①本願明細書の図５には、７．１Ｋｂのバックボーンを用いて調製されたＡＡＶに含まれるＤＮＡ不純物の量は、２．５Ｋｂのバックボーンを含むベクタープラスミドを用いた場合と比較して４０分の１にまで減少されていることが開示されており、②図５の比較例のバックボーンの長さ（２．５Ｋｂ）は引用例１に示されている２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐのバックボーンと近いことから、図５の比較例の２．５Ｋｂのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶ粒子には、引用例１に開示されている２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐのバックボーンを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ残存量と同程度であるとし、その値を前提として実施例２の７．１Ｋｂのバックボーンの長さを有するＤＮＡ不純物の量（４０分の１）を推定した上で、③本願明細書の【０１７７】、図５、図６、【０１７２】の各記載を参照することで、本願明細書には、サイズ超過のバックボーンの長さを長くすることで残存ＤＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなることが開示されていることを前提として、本願発

5 明３０の組換えベクタープラスミドは７．１Ｋｂのバックボーンの長さを超過するものであるから、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ残存量は、②で推定された値よりも更に少ないものと理解することができる旨主張する。しかし、前記 オのとおり、本願明細書の図５の上段と下段では、バックボーンの長さがそれぞれ２．５Ｋｂ、７．１Ｋｂのベクタープラスミドであることが示されているものの、ベクタープラスミドに含まれる導入遺伝子の長さについて記載はなく、導入遺伝子の長さは図５の上段と下段では異なるものと認められるため、同じ導入遺伝子を用いてバックボーンの長さだけを調整した結果としてカプシド化した後のＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡの量が「約４０分の１」に減少したものと読み取ることはできない。のみならず、下段のベクタープラスミドについて「サイズ超過バックボーンを用いると残存プラスミドＤＮＡは約４０分の１（０．１～１．０％）に減少する」との記載があるものの、その実験条件や具体的な実験結果の記載は伴っておらず、どのように算出されたのかも不明であるから、本願明細書には上記①で主張されているような事項が開示されているとはいえず、また、図５の「２．５Ｋｂのバックボーンの長さを有する」ベクタープラスミドの導入遺伝子と引用例１の「２６２０ｂｐ又は２６３８ｂｐ」のバックボーンの長さを有するベクタープラスミドの導入遺伝子が同じものであるかは明らかでないにもかかわらず、引用例１で開示されているＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量を参照して、本願明細書の図５の下段の７．１Ｋｂのバックボーンの長さを有するベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶ粒子に含まれるＤＮＡ不純物の量を推定することも相当ではない。加えて、③で原告が指摘する本願明細書の記載については、そもそもベクタープラスミドに含まれる導入遺伝子の長さが不明であるところ、サイ

5 ズ超過のバックボーンを含まないベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶ粒子中のプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量と、サイズ超過のバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて調製されたＡＡＶ粒子中のプラスミド由来のＤＮＡ不純物の量を比較したものにすぎず、サイズ超過のバックボーンを有するベクタープラスミド間でバックボーンの長さとプラスミドＤＮＡ不純物の量の関係を示す実験結果ではなく、これらの記載は、パッケージング許容限界より長いサイズ超過のバックボーンをより長くすればするほどＤＮＡ不純物の量が減少することを示すものではないから、本願明細書には、サイズ超過のバックボーンの長さを長くすることでＤＮＡ不純物の量の減少幅が大きくなることが開示されているとはいえない。以上によれば、上記アの①ないし③を論拠として、本願発明３０のＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡの量が２．６９±０．６９ｐｇ／１０ ９ｖｇよりも更に少ないと直ちに認めることはできないし、残存ＤＮＡの量の減少が生じたとしても、その減少がサイズ超過のバックボーンの長さを長くしたことによるものと直ちに認めることもできないから、原告の上記主張は、その前提において誤りがある。イ なお、本件審決は、前記第２の３ アのとおり、本願発明３０に含まれるＤＮＡ不純物の量は「６０ｐｇ／１０ ９ｖｇ程度」として引用発明との対比判断をするが、この値は、実施例３の６．９Ｋｂのバックボーンの長さを有するプラスミドを用いて調製したＡＡＶ粒子に含まれるプラスミド由来のＤＮＡの不純物の量であるところ（【０１７７】、図６）、本願発明３０の「フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列」の長さが７．０ないし１０．０Ｋｂを有するベクタープラスミドはこの実施例のバックボーンの長さを超えるものであるから、原告が前記第３の１ ア において指摘するとおり、何ら説明を加えることなく，実施例３の値を参照して

5 対比判断をした本件審決の判断には相当ではない部分があるが、これまで説示したところによれば、結論を左右するものではない。小括以上によれば、本願発明３０と引用発明を対比すると、本願発明３０と引用発明における各ＡＡＶ粒子に含まれる残存ＤＮＡ不純物の量やその程度が不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さにより相違することについては、これを直ちに認めることはできず、また、不活性のフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列の長さが相違するものの、発明の技術的意義に照らし有意なものと認めることはできないから、この長さの相違は実質的な相違点であるということはできない。そうすると、本願発明３０は、引用文献１に記載された発明であるといえるから、新規性を欠くものというべきである。原告は、その他、るる主張するが、いずれも上記結論を左右し得ない。

４ 結論以上によれば、原告が主張する取消事由は理由がなく、本願発明３０は、特許法２９条１項３号に該当し、特許を受けることができないから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶されるべきものであるとした本件審決は、結論において相当であるから、原告の請求は棄却されるべきである。よって、主文のとおり判決する。

知的財産高等裁判所第４部

裁判長裁判官

菅 野 雅 之

裁判官

中 村 恭

裁判官

岡 山 忠 広

（別紙１）

本願明細書（抜粋）【発明の詳細な説明】

5 【０００２】組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、今日までにいくつかの初期臨床試験において治療用途に極めて有望であることが複数のグループによる報告で示されている。この新規なクラスの生物学的製品を後期臨床試験に進め、最終的に医薬品としての認可を得るためにはベクターの特性解析および品質管理手法を更に改善する必要がある。例えば、臨床等級の精製ベクターにおける不純物プロファイルに、ベクター設計と製造工程パラメータがどのように影響するかについての更なる理解が必要である。ＡＡＶベクター中に存在するＤＮＡ不純物の除去は、ベクター精製中に処理可能な核酸を効率良く取り除くことが出来るヌクレアーゼ処理を行っても、ＤＮＡ断片がパッケージされ、ベクター粒子の完全性を保ち得るような様式で行われるヌクレアーゼ処理に対しては抵抗性になる可能性があるという事実によって複雑なものとなる。【０００３】ｒＡＡＶ作製システムの設計における重要な目的は、野生型・偽野生型ＡＡＶ種（ｗｔＡＡＶ）、ＡＡＶ内でカプシド化された残存ＤＮＡ不純物および空のカプシドを含む、ベクター関連不純物の特性を分析し、それらの生成を極小化・管理し得る戦略を遂行することである。このような生成物関連不純物はベクターそのものと酷似しており、精製過程中に真正のベクターから容易に分離できない。ベクター以外のＤＮＡ不純物はベクター粒子精製物の総ＤＮＡ量の１～８％を占めると報告されている（Ｓｍｉｔｈ ＰＨ Ｗｒｉｇｈｔ ＪＦ． Ｑｕ Ｇ． ｅｔ ａｌ ２００３， Ｍｏ． Ｔｈｅｒａｐｙ， ７：８３４８； Ｃｈａｄｅｕｆ Ｇ． Ｃｉｒｏｎ Ｃ． Ｍｏｕｌｌｉｅｒ Ｐ． Ｓａｌｖｅｔｔｉ Ａ．， Ｍｏ． Ｔｈｅｒａｐｙ ２００５， １２：７４４． ヒト用医薬品委員会（ＣＨＭＰ）遺伝子治療 専門家会合による報告． 欧州医薬品庁 ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ ２００５，１８３９８９／２００４）。カプシド化した残存ＤＮＡの多くは、逆方向末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ， ＩＴＲ）を含むベクタープラスミ5 ドテンプレートに由来する。【発明の概要】【０００４】本発明は、組換えベクタープラスミドおよびベクターゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス粒子を提供する。一実施形態では、組換えベクタープラスミドは、異種ポリヌクレオチド配列と、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）ポリヌクレオチド配列またはスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ポリヌクレオチド配列を含む。【０００５】本発明はまた、ＡＡＶベクタープラスミドおよびＡＡＶベクターゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ＡＡＶ粒子を提供する。一実施形態では、組換えＡＡＶベクタープラスミドは、異種ポリヌクレオチド配列と、フィラーポリヌクレオチド配列またはスタッファーポリヌクレオチド配列を含む。【０００６】種々の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列の長さは約４．７Ｋｂ未満とする。特定の態様では、異種ポリヌクレオチド配列は。長さが約４．７Ｋｂ未満で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の内側に位置するものとする。特定の態様では、異種ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を合わせた全体の長さは、約３．０～５．５Ｋｂ、または約４．０～５．０Ｋｂ、または約４．３～４．８Ｋｂとする。【０００７】フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、ベクターの機能または活性を損なわない限り、ベクター内の任意の所望の位置に配置することができる。ある態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’ 末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側ＩＴＲ配列の間には配置されないものとする。別の態様では、5 フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側ＩＴＲ配列の間に配置されるものとする。さらに別の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の５’末端および／または３’末端の外側にそれぞれ隣接する５’側および／または３’側ＩＴＲ配列に隣接して配置されるものとする。またさらに別の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、例えばゲノム核酸中のイントロンのように異種ポリヌクレオチド配列内に配置されるものとする。【０００８】従って、種々の実施形態では、１つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の内側に位置する、または、１つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の外側に位置する、または、２つのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列があり、第１のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の内側に位置し、第２のフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の２か所のＩＴＲ配列の外側に位置することになる。【０００９】さらにまた種々の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、その長さが１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００、２，５００～３，０００、３，０００～３，５００、３，５００～４，０００、４，０００～４，５００、４，５００～５，０００、５，５００～６，０００、６，０００～７，０００、７，０００～８，０００または８，００5 ０～９，０００ヌクレオチドの配列とする。【００１０】さらに特定の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の間に位置する場合には、異種ポリヌクレオチド配列とフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列を合わせた全体の長さは、約３．０～５．５Ｋｂ、または約４．０～５．０Ｋｂ、または約４．３～４．８Ｋｂとする。また別の特定の態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の二か所のＩＴＲ配列の外側に位置する場合には、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列の長さは４．７Ｋｂを超えるものとし、約５．０～１０．０Ｋｂまたは約６．０～８．０Ｋｂとする。【００１２】ある態様では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は不活性または無害であり、機能や活性を有しない。種々の特定の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は細菌のポリヌクレオチド配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列はタンパク質やペプチドをコードする配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は異種ポリヌクレオチド配列、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、発現制御要素、複製起点、選択マーカーまたはポリアデニン（ｐｏｌｙ－Ａ）配列のいずれとも異なる配列である。【００１４】本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子において、異種ポリヌクレオチド配列は転写され引き続きタンパクに翻訳されるか、またはそれ自体で機能や活性を有する転写物に転写され得る。ある実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は治療効果を有するタンパク質をコ5 ードする。特定の実施形態では、当該タンパク質は、血液凝固因子（例えば第ＸＩＩＩ因子・・・）、・・・である。【００１８】本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、シスまたはトランスで機能する追加の要素を含む。特定の実施形態では、組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドおよび／または組換えベクター（例えばＡＡＶ）ゲノムを含む（カプシド化する、またはパッケージする）ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子はまた、異種ポリヌクレオチド配列の’５末端または３’末端に隣接する一つ以上の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、異種ポリヌクレオチド配列の転写を駆動する発現調節配列（例えば構成的または制御可能な調節配列の様に異種ポリヌクレオチド配列の転写に寄与するプロモーターまたはエンハンサー、または組織特異的発現調節要素）、異種ポリヌクレオチド配列の３‘に位置するポリアデニン配列、選択マーカー（例えばカナマイシン抵抗性の様な抗生物質抵抗性を付与するタンパク質）、および／または複製の起点を含む。【図面の簡単な説明】【００２７】【図１】精製されたＡＡＶベクター調製物に含まれるプラスミドＤＮＡ不純物のレベルが導入遺伝子カセットの大きさに依存することを示す。【００２８】【図２】ＰＣＲおよび導入遺伝子カセットと上流側のプラスミドバックボーン配列にわたる領域をカバーする一連のプライマーを用いて行ったベクターゲノムの５’末端のマッピングを、ＤＮａｓｅ１処理の前後で示す。導入遺伝子カセット内部に位置する単独のプライマー（円で囲む）を、導入遺伝子カセットと抗生物質耐性遺伝子（ＫａｎＲおよびＡｍｐＲ）を含むプラスミドバックボーンの隣接断片の配列にわたるプライマーと組み合わせて使用した。ＰＣＲ反応は１％アガロースゲル電5 気泳動法で解析された。【００２９】図２Ａ～２Ｄは、ＤＮａｓｅ処理の前後のショートまたはロング導入遺伝子カセットを含むベクターのＰＣＲを示す。【図２Ａ】ＤＮａｓｅ処理前のショート導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。【図２Ｂ】ＤＮａｓｅ処理およびＤＮＡ精製後のショート導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。【図２Ｃ】ＤＮａｓｅ処理前のロング導入遺伝子カセット（４．３ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。【図２Ｄ】ＤＮａｓｅ処理およびＤＮＡ精製後のロング導入遺伝子カセット（４．２ｋｂ）を含むベクターのＰＣＲを示す。【００３０】図３Ａ～３Ｂは、導入遺伝子カセットを含む生産プラスミドＤＮＡに対して前述の一連のプライマーセットを用いて行ったプラスミドコントロール（対照）ＰＣＲを、ＤＮａｓｅ １処理の前後で示す。【図３Ａ】導入遺伝子カセット（２．７ｋｂ）を含むプラスミドを示す。【図３Ｂ】導入遺伝子カセット（４．３ｋｂ）を含むプラスミドを示す。【図３Ｃ】ＤＮａｓｅ処理後のプラスミドサンプルを示す。【００３１】【図４】ショート導入遺伝子カセットを含むベクター内へのプラスミドＤＮＡのカプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）の略図を示す。【００３２】【図５】トランス（ｔｒａｎｓ）に存在するＡＡＶのパッケージング許容限界サイズを超えるサイズ超過プラスミドバックボーン（７．１Ｋｂ）が、ベクター以外のＤＮＡのパッケージングを著しく低下させることを示す。5 【００３３】【図６】通常サイズ（円）対サイズ超過（三角）のバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて作成されたＡＡＶベクターの精製物中に含まれる残存プラスミドＤＮＡを示す。【発明を実施するための形態】【００３４】ここに開示される研究は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズ（約４．７ｋｂ）より短いベクター発現カセットを含むｒＡＡＶベクタープラスミドでは、残留プラスミドＤＮＡ不純物のレベルが上昇したこと、および配列がｒＡＡＶの本来のパッケージング許容限界サイズより短いほど不純物のレベルが上昇したことを示す。具体的な例を示すと、ｒＡＡＶのＡ（２．７ｋｂサイズ）は１６４ｐｇ／１０ 9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝９）。ｒＡＡＶのＢ（３．７ｋｂサイズ）は４２．７ｐｇ／１０ 9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝３２）。ｒＡＡＶのＣ（４．３ｋｂサイズ）は１４．０ｐｇ／１０9ｖｇの残存プラスミドＤＮＡを含んでいた（ｎ＝２９） よって、。これらの研究は、ベクターの設計時に発現カセットの長さをウイルス（ＡＡＶ）のカプシドの（本来の）パッケージング許容限界サイズと同じかそれに近くなるように調整することで、夾雑核酸のカプシド化を低減または阻止でき、よってカプシド化した核酸不純物を含むウイルス（ＡＡＶ）粒子が減少することを示す。【００３５】従って本発明は、ウイルス（ＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズの配列を有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミド、および該組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドを、例えば、残存ＤＮＡ不純物量を少なくしたかまたはこれを含まない組換えウイルス粒子を作成するために用いる方法を提供する。例えば、ベクターゲノム配列のサイズを最適化することで、抗生物質抵抗性を生じる細菌遺伝子の様な望ましくない核酸配列のベクターを介した導入に関5 わる潜在的危険性を軽減できる。【００３６】パッケージされた（カプシド化された）領域（「ベクター」または「ベクターゲノム」と称される）がウイルス（例えばＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズを有する本発明の組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、望ましいまたは治療的効果を提供するタンパク質をコードする配列（遺伝子）の様な異種ポリヌクレオチド配列、ならびに望ましくないまたは欠陥のある（たとえば病原性の）遺伝子の発現を低下または阻害する抑制性（例えばアンチセンス）核酸の導入・送達に用いることができ、従って種々の疾病を治療し得る。例えば、パッケージされた（カプシド化された）領域（ベクターゲノム）がウイルス（ＡＡＶ）の本来のパッケージング許容限界サイズに近いサイズの配列を有する組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドは、Ａ型またはＢ型血友病の様な遺伝的欠損疾患、他の代謝または血漿タンパク質の欠陥の治療、および他の治療目的のために治療的遺伝子を導入・送達するために用いることができる。【００４０】組換え「ベクタープラスミド」および「ＡＡＶベクタープラスミド」は、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムに由来し、分子学的手法を用いてウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを取り除き、異種ポリヌクレオチド配列（例えば治療的遺伝子発現カセット）の様な外来の核酸で置換している。通常は、ＡＡＶの場合には、野生型ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の片方または両方がＡＡＶベクタープラスミドに残される。ウイルスゲノムの全体または一部が異種ポリヌクレオチド配列によって置換されており、該異種ポリヌクレオチド配列は通常はウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノム核酸に対しては外来の核酸であるので、ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）はウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムとは区別される。【００７８】「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドの挿入または組み込みによって操作5 することができるプラスミド、ウイルス（例えばＡＡＶベクター）、コスミドまたは他の輸送媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を指す。そのようなベクターは、ポリヌクレオチドを細胞内に導入・移入し、細胞内に挿入されたポリヌクレオチドを転写または翻訳するための遺伝子操作（すなわち「クローニングベクター」）に用いることができる。ベクタープラスミドは一般に、細胞内で増殖するための複製起点を少なくとも一つ含み、随意に、異種ポリヌクレオチド配列、発現調節因子（例えばプロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（例えば抗生物質抵抗性）、ポリアデニン配列のような追加因子を含む。【００８０】組換えベクタープラスミドについては、ベクターゲノムは、ウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージまたはカプシド化され、異種ポリヌクレオチド配列を含むベクタープラスミドの一部を指す。組換えベクタープラスミドのプラスミド部位は、ヘルパー細胞のトランスフェクションおよび細胞によるベクターゲノムをパッケージ／カプシド化するウイルスの産生に用いられるバックボーン配列を含むが、それ自体はウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージ／カプシド化されない。【００８２】ここで定義される組換えベクタープラスミドは、パッケージまたはカプシド化されて感染能力のあるウイルス粒子を形成するウイルスゲノム配列の正常なサイズ、またはそれに近いサイズに長さを変更または調節する、追加的なフィラー／スタッファー核酸配列を含む。種々の実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパクをコードしない）断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）である。ＡＡＶベクターの特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、その長さが４．７Ｋｂ未満であり、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列と合わせた（例えばベクター内に挿入された）時の全長が約３．０～５．５Ｋｂ、または４．０～５．０ｋｂ、または４．３～４．８ｋｂである。 ・・ ・【００８３】5 ここで開示されるように、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列、調節因子、ＩＴＲ、複製起点、選択マーカー等の他の配列に対して、組換えベクタープラスミド内のベクター機能と両立できる任意の位置にあってよい。ある特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の３’末端と５’末端にそれぞれ隣接する３’ＩＴＲと５’ＩＴＲとの間に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおいては、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラスミドのベクターゲノム部分内に存在し、従ってウイルスのパッケージ／カプシド化に用いられる。別の特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の３’末端と５’末端にそれぞれ隣接する３’ＩＴＲと５’ＩＴＲの外側に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおいては、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラスミドのバックボーンまたはプラスミド部分内に存在する。また別の特定の形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の内部に位置し、例えばＡＡＶベクタープラスミドにおいては、異種ポリヌクレオチド配列の内部に位置するフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、組換えベクタープラスミドのベクターゲノム部分内に存在し、従ってウイルスのパッケージ／カプシド化に用いられる。実施例実施例１【０１６２】標準的ＰＣＲを、ＰＣＲ増幅の陽性対照としてＡＡＶベクターゲノム配列を含むプラスミッドＤＮＡ（図３、パネルＡとＢ）、精製ベクター調製物から抽出されたベクターゲノムＤＮＡ（図２、パネルＡとＣ、それぞれベクターゲノムサイズが２．７Ｋｂおよび４．２Ｋｂ）、およびベクターをＤＮａｓｅ Ｉで処理した後抽出されたベクターゲノムＤＮＡ（図２、パネルＢとＤ、それぞれベクターゲノムサイズが5 ２．７Ｋｂおよび４．２Ｋｂ）に対して実施した。導入遺伝子カセット内に位置するプライマー（図の赤丸）は、導入遺伝子カセット中の配列と、抗生物質耐性遺伝子（ＫａｎＲまたはＡｍｐＲ）を含むプラスミドバックボーンの隣接断片中の配列とをカバーする一組のプライマーと対を構成し、それぞれのＰＣＲに用いられた。ＰＣＲ反応物は１％アガロース／ＥｔＢｒゲル電気泳動法によって解析された。【０１６３】図３のデータ、ＰＣＲ増幅の対照、プラスミドＤＮＡ。プラスミドＤＮＡがテンプレートとして用いられたとき、すべてのプライマー対（９プライマー対、パネルＡとＢ）についてＰＣＲ断片が生成し、本研究で使われたすべてのプライマー対がＰＣＲ産物を生成することが示唆された。すべてのＰＣＲ産物は、プラスミド配列とプライマーの位置に基づいて予測される期待されたサイズを示した。期待されたとおり、ＰＣＲ前にプラスミドサンプルがＤＮａｓｅ Ｉで処理された場合には、ＰＣＲ増幅は認められなかった（パネルＣ）。【０１６４】図２のデータ。精製されたベクターから抽出されたＤＮＡに対してＰＣＲが行われたときには、一組のプライマー対のみが実験でＰＣＲ産物を与えた（２．７Ｋｂの短いゲノムを有するベクターに６プライマー対（パネルＡとＢ）、４．２Ｋｂの長いゲノムを有するベクターに４プライマー対（パネルＣとＤ））。ＰＣＲ産物の最大のサイズ（ＰＣＲ増幅の外側のベクターゲノム配列と併せて）は、増幅されたＤＮＡの最大サイズがＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）と対応することを示した。【０１６５】ベクターからＤＮＡを抽出する前にベクター調製物を ＤＮａｓｅ Ｉで処理しても（図２、パネルＢとＤ）、ＰＣＲ増幅パターンに変化は認められなかった（図２、パネルＡとＣを、それぞれパネルＢとＤと比較）。すなわち、ＰＣＲ産物を生成するプライマー対の数とＰＣＲ産物のサイズに変化は無く、ＰＣＲによって増幅され5 た配列（ベクターゲノムおよび隣接配列）は、ＤＮａｓｅから保護され、カプシド化されていることが示唆された。【０１６６】カプシド化されたＤＮＡのサイズ（例えばベクターゲノムサイズと併せたＤＮａｓｅ耐性プラスミドバックボーンＤＮＡ）は、短いゲノムを有するベクターと長いゲノムを有するベクターとで同等であり、ＡＡＶウイルスのパッケージング許容限界（４．５Ｋｂ）にほぼ対応した。短いゲノムを有するベクター内にパッケージされたＤＮＡは、ゲノムに隣接するプラスミド配列を含み、短いゲノムを有するベクターは、ＡＡＶウイルスの最大パッケージング許容限界までのサイズのプラスミド配列をパッケージすることが示された。実施例２【０１６７】この実施例は、ＧＭＰ適合の製造工程を用いた組換えＡＡＶウイルスの生成および精製についての記述を含む。【０１６８】残存プラスミドＤＮＡのレベルは、以下のサイズ範囲の一本鎖標準導入遺伝子発現カセットを含む一連のＡＡＶ２ベクターにおいて評価された。すなわち、ｒＡＡＶ Ａは２．７ｋｂ（野生型のサイズの５７％）、ｒＡＡＶ Ｂは３．７ｋｂ（野生型の８３％）、およびｒＡＡＶ Ｃは４．３ｋｂ（野生型の９１％）である。構築物毎に複数のロットを、同一のプロセスを用いて生成および精製した。ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスを必要としないトランスフェクションによって作出され、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｆｏｒｏｓ ＳＯＨＳ）とｉｓＯＱＶＣｎｉｃ塩化セシウム超遠心の併用により精製された。【０１６９】残存プラスミドＤＮＡの濃度は、ベクター調製物１ｍｌ当たりのＫａｎＲ遺伝子コピー数として測定され、ＫａｎＲ（ＡｍｐＲ）のコピー数は完全長プラスミドの5 コピー数を示す（最悪の場合でも）と仮定して、ベクターゲノム（ｖｇ）の％、または１０ ９ ｖｇ当たりのｐｇとして表した。ベクターの力価および残存プラスミドＤＮＡの濃度は、導入遺伝子プラスミドのバックボーン内の導入遺伝子カセットの５’ＩＴＲの近傍に位置するＫａｎＲまたはＡｍｐＲ遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用い、ＴａｑＭａｎ技術を製造者のプロトコールに従って使用してリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定された。【０１７０】ＤＮａｓｅ実験では、１ｘ１０ 6 コピーのベクターゲノムまたはプラスミドが、５ＵのＤＮａｓｅ １によって消化された。増幅は、ＰＣＲ反応毎に５００コピー数のベクターゲノムまたはプラスミドを用いて標準的ＰＣＲによって行われた。短い導入遺伝子カセットを有するＡＡＶベクター中のプラスミドＤＮＡ不純物は、ＤＮａｓｅに抵抗性であり、ベクタープラスミドのＩＴＲの近傍のプラスミドＤＮＡ断片がカプシド化されたことが示された。【０１７１】残存プラスミドＤＮＡは、ベクターサンプル中の標的ｑＰＣＲ増幅産物のコピー数の測定値に基づき、保守的方法により定量された。すなわち、コピー数にプラスミドのＭｒを乗じて算出された。導入遺伝子カセットサイズの関数としての不純物レベルを図１に要約した。評価により、ｒＡＡＶ Ａ（サイズは２．７ｋｂ）は１６４ ｐｇ／１０9ｖｇ（ｎ＝９）、ｒＡＡＶ Ｂ（サイズは３．７ｋｂ）は４２．７ｐｇ／１０ 9ｖｇ（ｎ＝３２）、そして ｒＡＡＶ Ｃ（サイズは４．３ｋｂ）は１４．０ｐｇ／１０9ｖｇ（ｎ＝２９）の残存プラスミドＤＮＡをそれぞれ含むことが示された。【０１７２】さらに、ベクタープラスミド「バックボーン」ＤＮＡのパッケージングが、ＩＴＲからの「逆転パッケージング」を介してかなりの程度で起こり、それはサイズ超過（＞４．７ｂｐ）のバックボーンを用いることで大幅に減少する（図５）。5 実施例３【０１７３】この実施例は、サイズ超過バックボーンを用いずに調製されたベクターのＤＮＡ不純物を、サイズ超過バックボーンを用いて調製したベクターと比較した研究についての記述を含む。【０１７４】ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の一過性トランスフェクションによるベクター産生に基づき、以下に記述するベクター産生および精製方法に従い、一連の１２バッチの組換えＡＡＶベクターを同一の方法で調製した。ＨＥＫ２９３細胞培養におけるベクター産生：１．Ｔ７５フラスコ内でＨＥＫ２９３のマスター・セル・バンク細胞の培養を開始２．細胞を約二個のＴ２２５フラスコに継代３．細胞を約二個のローラーボトルに継代４．細胞を約１０個のローラーボトルに継代５．細胞を約１０２個のローラーボトルに継代

６．サイズ超過ベクターバックボーンを有するべクタープラスミド、またはサイズ超過ベクターバックボーンを有しないべクタープラスミドを含むプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクション

７．無血清培地に交換ベクター精製（下流工程）：

８．ベクター含有細胞および培養液の回収

９．回収物のタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ （ＴＦＦ））（１００ ｋＤａ）による濃縮および透析ろ過

１０．濃縮された回収物の微細流動化

１１．微細流動化中間産物のろ過（０．６５μｍ／０．２μｍ連続細孔径）

１２．イオン交換クロマトグラフィーによる精製5 １３．塩化セシウム等密度勾配超遠心法による精製１４．ＴＦＦ（１００ ｋＤａ）によるバッファー交換１５．製剤化および０．２μｍろ過による精製バルクベクターの調製１６．最終０．２μｍろ過、バイアルへの充填、仕上げによるバイアル充填された精製ベクターの調製【０１７５】サイズ超過バックボーンを含む生産プラスミドベクターを用いて調製された９バッチのベクター、およびサイズ超過バックボーンを含まない生産プラスミドベクターを用いて調製された３バッチのベクターの精製ベクターのサンプルを、精製されたベクター生産物の一部であることが意図されない（よって不純物である）アンピシリンおよびカナマイシン抵抗性遺伝子の残存レベルのｑＰＣＲ測定によって決定される残存宿主細胞プラスミドＤＮＡの測定に供した。この不純物の測定に用いた方法を以下に記す。リアルタイムｑＰＣＲによる残存プラスミドＤＮＡ【０１７６】記述されたＴａｑＭａｎR リアルタイムｑＰＣＲ手法は、標的特異的Ｑ－ＰＣＲプライマーおよびプローブを用いて、ベクター生成に用いられた生産プラスミド内の特異的配列（Ａｍｐ R またはＫａｎR）を検出する。一つの標的がベクター製造で用いられたすべてのプラスミドに共通である場合には、総残存プラスミドは単回のｑＰＣＲ試験で決定された。Ａｍｐ R およびＫａｎ R の両方がある特定のバッチの一つ以上の生産プラスミド内に存在する場合には、総残存プラスミドはそれぞれ別々の試験で決定されたＡｍｐ R の残渣ＤＮＡとＫａｎ R の残渣ＤＮＡの和として算出された。・・・【０１７７】図６に示される１２の定量結果で得られた残存プラスミドＤＮＡ不純物レベルにおいては、サイズ超過バックボーンを含まない（欠く）ベクタープラスミドを用い5 て調製されたベクター中の１０ 9 ベクターゲノム当たりのプラスミドＤＮＡ不純物の平均は３０１ｐｇで、これはサイズ超過バックボーンを用いて調製されたベクターで測定された１０ 9ｖｇ当たりのプラスミドＤＮＡ不純物の平均である６０ｐｇと比較して、５倍高い値であった。従って、ベクタープラスミド内のサイズ超過バックボーンは、ウイルスベクターの調製において不純物の低減に使用することができる。

（別紙２）

（１－１）「・・・臨床用ベクター中のキャプシド形成するＤＮＡ不純物を最小限に抑えるため、次の２つの方法が用いられた。（ⅰ）ＡＡＶのパッケージング限界を超え5 るバックボーンを持つベクター（cis）製造用プラスミド；および（ⅱ）ベクターに関連する不純物（例：空キャプシド）からベクターの分離を達成するベクター精製工程。結論として、ＡＡＶ２－ｈＦＩＸ臨床用ベクターによる導入後、残留ｃａｐの発現は検出されなかった。」（１頁左欄１４～２０行）（１－２）「ベクタープラスミドのバックボーンサイズがＤＮＡの不純物レベルに与える影響これまでの研究では、キャプシド形成するプラスミドＤＮＡ不純物は、主にＩＴＲ含有ベクター（cis）製造用プラスミドのバックボーンに由来することが報告されていた。ベクタープラスミドのバックボーンサイズが、組換えＡＡＶ２およびＡＡＶ６における残留プラスミドＤＮＡ不純物の量に及ぼす影響が評価された。残留プラスミドＤＮＡのレベルは、ベクター生成に使用した３つの産生プラスミドに共通する配列であるＡｍｐ Ｒ に特異的なプライマーとプローブを用いたＱ－ＰＣＲで測定した（表１）。この実験で比較したベクターは、それぞれ共通の方法（chromatography-gradient）で生成及び精製されているため、ベクターの純度が高く、空キャプシドが除去されており、また非キャプシド形成型核酸の不純物が除去された、効率的なヌクレアーゼ消化工程が含まれた。ベクタープラスミドを用いて生成した５ロットの平均残留プラスミドＤＮＡレベルを測定したところ、特大（６９８０ｂｐ）のバックボーンを持つプラスミド（ロット ０６００２、００３Ａ、ＮＨＰ、０８０２、０８０３）は１４．２±２．６ｐｇ／１０９ｖｇで、それよりも小さい（２６２０ｂｐまたは２６３８ｂｐ）のバックボーンを持つベクタープラスミドを用いて作製された５ロット（ロット Ｎ０７０１、０７０１、０７０２、０７０３、０８０１）で測定された平均値１０７．６±２７．６ｐｇ／１０ ９ｖｇよりも７．６倍低かった（Ｐ＜０．００１）。そのため、ベクター製造用プラスミドに特大のバックボーンを使用することで、プラス5 ミド由来のＤＮＡ不純物の大幅な削減が達成された。」（１４６頁右欄１７～４０行）（１－３）（１４７頁表 １ ）（１－４）「今回の研究で、ＡＡＶのパッケージング限界よりも小さいバックボーンを持つベクタープラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入（トランスフェクション）してＡＡＶベクターを作製したところ、得られたベクターに含まれるヌクレオチド耐性プラスミドＤＮＡの不純物は２．９～５．７％であり、他者による過去の報告と一致していた。キャプシド形成するプラスミドＤＮＡの主なソースは、ＩＴＲを含むベクタープラスミドのバックボーンであった。・・・バックボーンがＡＡＶ２のパッケージング容量を超えるようにスタッファー配列を改変したベクタープラスミドを使用した場合の効果を調べたところ、この戦5 略により、キャプシド形成したプラスミドＤＮＡ不純物のレベルが大幅に減少することが判明した（７．６倍、Ｐ＜０．００１）。ＡＡＶ２以上のパッケージング容量を持つベクター血清型では、リバースパッケージングを防止するために必要なバックボーンサイズもそれに応じて大きくなることが予測される。」（１４９頁右欄下から１０行～１５０頁左欄８行）。（１－５）「材料および手法ＡＡＶの生成と精製。ベクターの生成は、改変した３個のプラスミドを用いたＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリーの遺伝子導入によって実施した。臨床用ＡＡＶ２－ｈＦＩＸベクターロット１０５３は、２回の塩化セシウム勾配超遠心法（gradient-only 法）により精製した。本研究では、さらに追加で１４ロットのＡＡＶベクターが製造され、分析が行われた。ヒト凝固第ＩＸ因子（ＡＡＶ－ｈＦＩＸ）を発現するＡＡＶ２ベクター８ロットとＡＡＶ６ベクター２ロットは、ＡＡＶのパッケージング限界である約４７００ｎｔを超過する６９８０ｂｐのバックボーンを含むベクタープラスミドを用いて作製した。１ロットのＡＡＶ２、４ロットのＡＡＶ６が２６２０ｂｐまたは２６３８ｂｐのバックボーンを持つベクタープラスミドを用いて作製された。（１５０頁左欄下から１１～１行）」