平成31(行ケ)10011審決取消請求事件

令和２年２月２５日判決言渡
平成３１年（行ケ）第１００１１号 審決取消請求事件
口頭弁論終結日 令和元年１２月１８日
判 決
原 告 ザ・ブロード・インスティテュート
・インコーポレイテッド
原 告 マサチューセッツ・インスティテュート
・オブ・テクノロジー
原告ら訴訟代理人弁護士 大 野 聖 二
多 田 宏 文
原告ら訴訟代理人弁理士 森 田 裕
今 野 智 介
大 木 信 人
実 広 信 哉
堀 江 健 太 郎
楠 田 大 輔
佐 伯 圭
被 告 特許庁長官
同 指 定 代 理 人 小 暮 道 明
長 井 啓 子
田 村 聖 子
原 賢 一
主 文
１ 特許庁が不服２０１７－１３７９６号事件について
平成３０年９月１４日にした審決を取り消す。
２ 訴訟費用は被告の負担とする。
事実及び理由
第１ 請求
主文第１項と同旨
第２ 事案の概要
１ 特許庁における手続の経緯等
⑴ 原告らは，平成２８年６月２９日，発明の名称を「遺伝子産物の発現を変更
するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系および方法」とする特許出願をした（特願２０
１６－１２８５９９。特願２０１５－５４７５５５（優先権主張：平成２４年１２
月１２日・米国）の分割。公開日：平成２８年９月２９日。甲９）。
⑵ 原告らは，平成２９年５月９日付けで拒絶査定を受けたことから（甲１３），
同年９月１５日，これに対する不服審判の請求をし（甲１４），特許庁は，上記請求
を不服２０１７－１３７９６事件として審理した。
⑶ 特許庁は，平成３０年９月１４日，本件審判請求は成り立たないとする別紙
審決書（写し）記載の審決（以下「本件審決」という。）をし，その謄本は，同年１
０月１日，原告らに送達された。
⑷ 原告らは，平成３１年１月２９日，本件審決の取消しを求める本件訴えを提
起した。
２ 特許請求の範囲の記載
本件審決が対象とした特許請求の範囲請求項１の記載は，以下のとおりである（甲
１２。以下，上記請求項１に記載された発明を「本願発明」といい，この出願に係る
明細書（甲９）を，図面を含めて「本願明細書」という。。なお，文中の「／」は，
）
原文の改行箇所を示す（以下同じ）。
【請求項１】
エンジニアリングされた，天然に存在しないクラスター化等間隔短鎖回分リピー
ト（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ベクタ
ー系であって，／ａ）真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイ
ブリダイズする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする１つ
以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって，
前記ガイドＲＮＡが，ガイド配列，ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列を含
む，第１の調節エレメント，／ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレ
オチド配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントであって，前記タンパ
ク質が，核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む，第２の調節エレメント／を含む１つ以
上のベクターを含み；／成分（ａ）及び（ｂ）が，前記系の同じ又は異なるベクター
上に位置し，／前記ｔｒａｃｒ配列が，３０以上のヌクレオチドの長さを有し，／
それによって，前記１つ以上のガイドＲＮＡが，真核細胞中の前記ポリヌクレオチ
ド遺伝子座を標的とし，前記Ｃａｓ９タンパク質が，前記ポリヌクレオチド遺伝子
座を開裂し，それによって，前記ポリヌクレオチド遺伝子座の配列が，改変され；前
記Ｃａｓ９タンパク質及び前記１つ以上のガイドＲＮＡが，いっしょに天然に存在
しない，／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系。
３ 本件審決の理由の要旨
⑴ 本件審決の理由は，別紙審決書（写し）記載のとおりである。要するに，本願
発明は，①先願の下記引用例１に記載された発明（以下「引用発明１」という。）と
同一であるから，特許法２９条の２に該当し，②下記引用例２に記載された発明（以
下「引用発明２」という。）及び本願優先日（２０１２年１２月１２日）前の周知技
術に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるから，同法２９
条２項に該当するので，特許を受けることができない，というものである。
ア 引用例１：ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７３３０７号（国際公開第２０１４／
０８９２９０号。出願日：２０１３年１２月５日（優先権主張:２０１２年１２月６
日），公開日：２０１４年６月１２日。甲１の１）
イ 引 用 例 ２ ： A Programmable Dual-RNA ‐ Guided DNA Endonuclease in
“
Adaptive Bacterial Immunity”（Science, Aug 2012, Vol.337, p.816-821。甲２の
１）及び“Supplementary Materials”
（甲２の２）
（オンラインによる公開:２０１２
年６月２８日）
⑵ 本件審決は，引用発明１，本願発明と引用発明１との対比について，以下の
とおり認定した。
ア 引用発明１の認定
（ｉ）少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＩＩ型Ｃａｓ
９タンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーター調節配列を含
むベクター，及び，／（ⅱ）真核細胞中の染色体配列中の標的部位に相補的である
５’末端における第一の領域，ステムループ構造を形成する第二の内部領域，及び
本質的に一本鎖のままである第三の３’領域を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ
をコードするＤＮＡに操作可能に連結されたプロモーター調節配列を含むベクター，
／を含むベクター系であって，前記ガイドＲＮＡの第二及び第三領域の合わせた長
さが，約３０から約１２０ヌクレオチド長の範囲であり，前記ガイドＲＮＡが，Ｉ
Ｉ型Ｃａｓ９タンパク質を真核細胞中の染色体配列中の標的部位へ誘導し，そこで
該ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質が，該標的部位にて染色体ＤＮＡ二本鎖の切断を誘導
し，該二本鎖の切断が，染色体配列が修飾されるようにＤＮＡ修復過程により修復
される，ベクター系。
イ 本願発明と引用発明１の一致点
エンジニアリングされた，天然に存在しないクラスター化等間隔短鎖回分リピー
ト（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ベクタ
ー系であって，／ａ）真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイ
ブリダイズする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする１つ
以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって，
前記ガイドＲＮＡが，ガイド配列，ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列を含
む，第１の調節エレメント，／ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレ
オチド配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントであって，前記タンパ
ク質が，核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む，第２の調節エレメントを含む１つ以上
のベクターを含み；／成分（ａ） （ｂ） 前記系の異なるベクター上に位置し，
及び が，
／それによって，前記１つ以上のガイドＲＮＡが，真核細胞中の前記ポリヌクレオ
チド遺伝子座を標的とし，前記Ｃａｓ９タンパク質が，前記ポリヌクレオチド遺伝
子座を開裂し，それによって，前記ポリヌクレオチド遺伝子座の配列が，改変され；
前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記１つ以上のガイドＲＮＡが，いっしょに天然に存
在しない，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系。
ウ 一応の相違点
本願発明は「ｔｒａｃｒ配列が，３０以上のヌクレオチドの長さを有」するもの
であると下限値が特定されているのに対して，引用発明１では，本願発明の「ｔｒ
ａｃｒ配列」に相当する部分の長さについて明確な特定はないものの，
「第二及び第
三領域」の合わせた長さが「約３０から約１２０ヌクレオチド長の範囲」である限
りにおいて，３０ヌクレオチドよりも短い場合をも包含する点。
⑶ 本件審決は，引用発明２，本願発明と引用発明２との対比について，以下の
とおり認定した。
ア 引用発明２の認定
エンジニアリングされた，天然に存在しないクラスター化等間隔短鎖回分リピー
ト（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）系であ
って，／ａ）標的認識配列を５’末端に含み，その下流にｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲ
ＮＡの間に生じる塩基対相互作用を保持するヘアピン構造を含み，前記標的認識配
列が緩衝液中で標的配列にハイブリダイズするキメラＲＮＡであるキメラＡと，／
ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質，／を含み，／前記ｔｒａｃｒＲＮＡが，２６のヌク
レオチドの長さを有し，／それによって，前記Ｃａｓ９タンパク質が，前記標的配
列を開裂し，／前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記キメラＲＮＡが，いっしょに天然
に存在しない，／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
イ 本願発明と引用発明２との一致点
エンジニアリングされた，天然に存在しないクラスター化等間隔短鎖回分リピー
ト（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）系であ
って，／ａ）標的配列にハイブリダイズする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガ
イドＲＮＡであって，ガイド配列，ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列を含
むガイドＲＮＡと，／ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質，／を含み，／それによって，
前記Ｃａｓ９タンパク質が，前記標的配列を開裂し，／ 前記Ｃａｓ９タンパク質及
び前記１つ以上のガイドＲＮＡが，いっしょに天然に存在しない，／ＣＲＩＳＰＲ
－Ｃａｓ系。
ウ 本願発明と引用発明２との相違点
（相違点１）
本願発明は，ガイドＲＮＡが，
「真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の標的
配列にハイブリダイズ」し，ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質が，
「核局在化シグナル（Ｎ
ＬＳ）を含む」ことによって，ガイドＲＮＡが，
「真核細胞中の前記ポリヌクレオチ
ド遺伝子座」を標的とし，Ｃａｓ９タンパク質がこれを開裂するのに対して，引用
発明２では，標的配列が緩衝液中に存在し，Ｃａｓ９タンパク質が核局在化シグナ
ルを有していない点。
（相違点２）
本願発明は， 前記ポリヌクレオチド遺伝子座の配列が，
「 改変され」るのに対して，
引用発明２では，標的配列を開裂するにとどまる点。
（相違点３）
本願発明は，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡを「コードする１つ以上のヌ
クレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント」と，ＩＩ型Ｃａ
ｓ９タンパク質を「コードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している第２の
調節エレメント」を含む「１つ以上のベクターを含み；成分（ａ）及び（ｂ）が，前
記系の同じ又は異なるベクター上に位置」する，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ「ベクター」
系であるのに対して，引用発明２では，「キメラＲＮＡ」と「Ｃａｓ９タンパク質」
を用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である点。
（相違点４）
本願発明は，前記ｔｒａｃｒ配列が，
「３０以上のヌクレオチドの長さ」を有する
のに対して，引用発明２は，それに対応する前記ｔｒａｃｒＲＮＡが，
「２６のヌク
レオチドの長さ」を有する点。
４ 取消事由
⑴ 引用発明１に基づく特許法２９条の２の判断の誤り（取消事由１）
⑵ 引用発明２に基づく進歩性の判断の誤り（取消事由２）
第３ 当事者の主張
１ 取消事由１（引用発明１に基づく特許法２９条の２の判断の誤り）について
〔原告らの主張〕
⑴ 一致点とされた部分について
ア 引用例１は，後記ウで詳述するとおり，標的部位において組換えが生じたこ
とを実験データによって示していない。引用発明１は，当業者が反復継続して所定
の効果を挙げることができる程度まで具体的・客観的なものとして構成されていな
いから，特許法２９条の２による後願排除効を有していないというべきである（東
京高裁平成１３年４月２５日判決・平成１０年（行ケ）第４０１号）。
イ 原核生物のＣＲＩＳＰＲシステムを真核細胞において作動するように適合さ
せられるか否かは，本願発明の発明者であるＡ博士（Ａ博士）が２０１３年の論文
（Ｂほか）において報告するまでは明らかでなく，引用例１に接した当業者は，引
用例１のＦＡＣＳ実験とＰＣＲ実験の矛盾した結果を検討し，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａ
ｓ９システムが真核細胞において作動するか否かが未解決であると結論したはずで
ある。引用例１の結果は，それが開示された２０１２年当時の技術常識に基づき，
後知恵を入れることなく検討されなければならない。
ウ 引用例１は，本願発明の構成「前記ガイド配列が，真核細胞中の前記１つ以
上のポリヌクレオチド遺伝子座を標的とし，前記Ｃａｓ９タンパク質が，前記遺伝
子座を開裂し，それによって，遺伝子座の配列が改変される」を開示していない。
引用例１には，ヒトのＫ５６２細胞の６つのトランスフェクション処理（処理Ａ
～Ｆ。表７．トランスフェクション処理）が記載されているところ，このうち本願発
明のクレームと同じベクター系に係るものは処理Ｄである。引用例１には，処理Ａ
～Ｆに対して行われた２つの実験が開示されており，これらの実験の目的は，ＣＲ
ＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系がゲノムＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列を開裂し，コー
ド配列をそこに組み込むかどうかを確認することにある。
ところが，実施例４の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）実験の処理Ｄの蛍光は，細
胞の死による自家蛍光とＧＦＰの自家蛍光を区別することができず，組換えがされ
たか否かや，組換えが標的部位でされたか否かを判断することができない。むしろ，
実施例５のＰＣＲ実験は，処理Ｄで標的部位の編集がされていないことを示してお
り，処理Ｄの蛍光が標的部位の遺伝子編集によるものでないことを裏付ける。
引用例１のＦＡＣＳ実験とＰＣＲ実験により得られた結果には矛盾があるので，
当業者は，この矛盾点を検討し，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが真核細胞にお
いて作動するか否かにはなお疑問があると判断したはずである。
このように，引用例１には，真核細胞内でのゲノムＤＮＡの標的部位での配列の
編集ができなかった系が記載されているにすぎないから，上記のとおりの配列の編
集ができる本願発明と実質的に同一であるということはできない。
エ 被告は，実施例５の処理Ｄにおいて，標的部位へのドナー配列の挿入が実験
で確認されていないとしても，それは，処理Ｄで採用した実験プロトコルに適切で
ない部分があったことに起因するものにすぎない旨主張するが，本願優先日当時の
技術水準において，適切な実験プロトコルは存在しなかった。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のような複雑な系をエンジニアリングするには，多くの
系の設計の選択が必要である。本願発明は，Ｃａｓ９に複数のＮＬＳを付加するこ
とやｔｒａｃｒＲＮＡの長さを長くすることの技術的意義，キメラＲＮＡの３’末
端にターミネーターとして例えばポリＴを挿入することなど，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａ
ｓ９システムを真核細胞内環境において真核生物のゲノムＤＮＡに適合させるガイ
ダンスを開示し，引用発明１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系とは異なる。
適切なプロトコル下に置かれた場合に引用発明１の系が真核細胞でも機能すると
考えることは，本願発明と引用発明１の系の相違を見誤っている。
⑵ 一応の相違点とされた部分について
本願発明では，ｔｒａｃｒ長が短い場合のゲノム編集効率を高めるために，Ｃａ
ｓ９に複数のＮＬＳを付加すること，ｔｒａｃｒＲＮＡの長さを長くすることの技
術的意義，キメラＲＮＡの３’末端にターミネータとして例えばポリＴを挿入する
ことなど，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを真核細胞内環境において真核生物の
ゲノムＤＮＡに適合させるガイダンスを開示している。
〔被告の主張〕
⑴ 一致点とされた部分について
引用例１には，
（ｉ）少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つの
ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーター
調節配列を含むベクター及び（ⅱ）真核細胞中の染色体配列中の標的部位に相補的
である５’末端における第一の領域，ステムループ構造を形成する第二の内部領域，
及び本質的に一本鎖のままである第三の３’領域を含む少なくとも１つのガイドＲ
ＮＡをコードするＤＮＡに操作可能に連結されたプロモーター調節配列を含むベク
ター，を含むベクター系が記載されている。
そして，引用例１には，上記のベクター系であって，
「ガイドＲＮＡが，ＩＩ型Ｃ
ａｓ９タンパク質を真核細胞中の染色体配列中の標的部位へ誘導し，そこで該ＩＩ
型Ｃａｓ９タンパク質が，該標的部位にて染色体ＤＮＡ二本鎖の切断を誘導し，該
二本鎖の切断が，染色体配列が修飾されるようにＤＮＡ修復過程により修復される」
との機能を発揮するように構成されているものが，引用発明として認定し得る程度
十分に，技術思想として開示されている。
実施例５の処理Ｄにおいて，標的部位へのドナー配列の挿入が実験で確認されて
いないとしても，それは，処理Ｄで採用した実験プロトコルに適切でない部分があ
ったことに起因するものであり，上記の認定を左右することはない。
⑵ 一応の相違点とされた部分について
本願発明と引用発明１は，本願発明の「ｔｒａｃｒ配列」に相当する部分の長さ
に関して重複関係にあるから，本願発明が特許を受けるためには，長さの下限値を
３０ヌクレオチド長と特定することにより，３０ヌクレオチドよりも短い場合をも
包含する引用発明１とは異なる新たな効果を有することが必要である。
２６ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ配列を有するガイドＲＮＡ（＋４８）と，３２
ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ配列を有するガイドＲＮＡ（＋５４）とで，プロトス
ペーサー２，４及び５を標的としたものでは差異を見出せない（図１６，図１７）。
そして，３０以上のヌクレオチド長と特定する本願発明においては，標的配列に依
存することなく，改変効率が向上するとの効果を有しているとはいえない。
２ 取消事由２（引用発明２に基づく進歩性の判断の誤り）について
〔原告らの主張〕
⑴ 引用発明の認定の誤り
本件審決がした引用発明２の認定は，引用例２に記載された発明を上位概念で認
定している点において不当である。引用発明２は，次のとおり，下線部を有するも
のとして認定されるべきである。
ａ）標的認識配列を５’末端に含み，その下流にｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡ
の間に生じる塩基対相互作用を保持するヘアピン構造を含み，前記標的認識配列が
緩衝液中で標的配列にハイブリダイズするキメラＲＮＡであるキメラＡであって，
試験管内で事前に９５℃で加熱してその後室温にまで冷却させて得られるキメラＡ
と，／ｂ）大腸菌（E. Coli）に産生させ，できるだけ純度高く精製したＩＩ型Ｃａ
ｓ９タンパク質と，／を複合体形成に適した緩衝液中で混合して得られる複合体を
含み，／それによって，前記Ｃａｓ９タンパク質が，開裂に適した緩衝液中で，オリ
ゴヌクレオチドＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ中の前記標的配列を開裂する，／ＣＲ
ＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
⑵ 相違点の看過等
ア 相違点５
引用例２においては，試験管内で転写されたキメラＡをＣａｓ９と混合してＣａ
ｓ９複合体を形成し，それを標的ＤＮＡと共に緩衝液環境に導入しているのに対し，
本願発明では，真核細胞内において構成要素がまず別々に，かつ適切に発現し，そ
の後，発現した構成要素が，真核細胞の核内においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合
体を形成しなければならない。
したがって，本願発明と引用発明２の相違点としては，本件審決が認定した相違
点１ないし３のほかに，
「本願発明は，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系であり，ベ
クターで真核細胞の核内にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの構成要素を送達するものであり，
本願発明で用いる複合体はあらかじめ形成させたものではないのに対して，引用発
明２では，用いる複合体は「複合体形成に適した緩衝液中で構成要素を混合して得
られる，事前に形成された複合体」である点（相違点４）を認定すべきである。
そして，引用発明２では，真核細胞内でのベクター系を用いたときにＣａｓ９と
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｔＲＮＡとの複合体が適切に形成するか否か，仮に形成でき
たとしても活性な複合体を形成し得るか不明であること，真核細胞には，二本鎖Ｒ
ＮＡを検知し，破壊し，除去する免疫機構が備わっており，ＣＲＩＳＰＲ複合体を
形成する前に，ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｔＲＮＡのような二本鎖ＲＮＡが十分な時間，
存在することができたとはいえないことから，この相違点は容易に想到できない。
イ 相違点６
引用例２で用いられたオリゴヌクレオチドＤＮＡやプラスミドＤＮＡは，染色体
構造（特に真核細胞の染色体構造）を形成するものではないのに対し，本願発明の
開裂対象は，真核細胞中の染色体配列中の標的部位であり，オリゴヌクレオチドＤ
ＮＡでもプラスミドＤＮＡでもなく，真核細胞のゲノムＤＮＡは，真核細胞の核に
存在し，かつ，染色体という構造を形成して安定化されていること，さらに，引用例
２が，開裂に適した環境下の試験管内の緩衝液中で行われるのに対し，本願発明は，
開裂に適した環境であるかが不明な真核細胞内で行う。
したがって，本願発明と引用発明２の相違点としては，更に，
「本願発明のＣＲＩ
ＳＰＲ－Ｃａｓベクター系は，真核細胞内環境下で，真核生物のゲノムＤＮＡ中の
標的部位を開裂するものであり，開裂に適した環境下の緩衝液中で開裂を行うもの
ではなく，開裂対象はオリゴヌクレオチドＤＮＡでもプラスミドＤＮＡでもないの
に対して，引用発明２は，開裂に適した緩衝液中で，オリゴヌクレオチドＤＮＡ又
はプラスミドＤＮＡ中の標的部位を開裂するものである点」
（相違点６）を認定すべ
きである。
そして，引用例２で開示されているのは，緩衝液において予め形成させた複合体
が，切断に適した緩衝液中でＤＮＡを切断したということだけであり，真核細胞に
おいて機能するかどうかを当業者に予測させるものではないから，相違点６は，引
用発明２から容易に想到することができない。
⑶ 相違点１，３及び４の判断の誤り
ア 相違点１に関する容易想到性判断の誤り
(ア) 本件審決は，本願発明は「真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の１つ
以上の標的配列にハイブリダイズ」するものであるのに対して，引用発明２はこの
ような構成を有しない点で相違すると認定する。
引用例２に開示されたのは，複合体形成に適した緩衝液中で予め形成させた複合
体を用いて，切断に適した緩衝液中で，オリゴヌクレオチドＤＮＡ又はプラスミド
ＤＮＡを切断したことであり，
「真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の１つ以
上の標的配列にハイブリダイズ」させることとは大きく異なる。
ベクター系を用いてＣａｓ９タンパク質や，ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを真
核細胞内で発現させた場合，これらの構成要素は，複合体として合成されるのでは
なく，それぞれが個別のものとして合成され，完成した後に，①真核細胞内で互い
に接触する必要があり，かつ，②接触後，適切に複合体形成することにより，活性な
複合体を形成する必要がある。仮に，当該複合体が形成されたとしても，③複合体
がゲノム全体をスキャンするに十分な時間存在していなければならない。その後に
初めて，
「真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の１つ以上の標的配列にハイブ
リダイズ」するために，標的配列に結合することができる。
①真核細胞内において複合体を形成することは困難で，②原核細胞ではＤＮＡか
らｍＲＮＡへの転写及びタンパク質の翻訳が細胞質で同時に起こるのに対し，真核
細胞では核内で転写が行われ，細胞質で翻訳が行われるように，転写と翻訳のシス
テムが異なり，③ゲノム構造と標的とされた遺伝子座への接触や④ゲノムサイズと
遺伝子座への接触も困難で，⑤原核生物における遺伝子ターゲティングシステムを
真核細胞に適用することについては失敗例も存在する。
(イ) 本件審決は，本願発明と引用発明２との相違点１が周知技術に基づいて容易
に想到できると判断する。
しかし，本件審決の上記判断において，Ｃａｓ９タンパク質に核局在化シグナル
を付加することにより，真核細胞の核内のゲノムにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を到
達させることができるとする科学的根拠は示されていない。
本件審決では，核局在化シグナルをＣａｓ９タンパク質に付加することが，タン
パク質を核内に移行させるための常套手段であるというが，常套手段として挙げら
れているものは，いずれも細胞内で複合体を形成する必要がなく，かつ，細胞内で
機能するためにＲＮＡの必要のない技術に関するものであって，単にタンパク質の
みを核に移行させればその機能を発揮することが明白な技術であるから，細胞内に
おいて複合体形成を必要とするＣａｓ９複合体とは異なる。
第１優先日当時にはＮＬＳがＣａｓ９複合体を真核細胞内で機能させる手法であ
るかは不明であり，引用例２では，核局在化シグナルについて開示も示唆もない。
イ 相違点３に関する容易想到性判断の誤り
細胞の内部で複合体を形成することなく機能する所望のタンパク質や核酸などの
因子を機能させようとする場合に，それらを発現するベクターを用いることは常套
手段であるとしても，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは複合体でなければ機能し
ないことが，引用例２において明確に実証されているのであるから，ＣＲＩＳＰＲ
－Ｃａｓ９システムをベクターで，しかも，原核細胞ではなく真核細胞に導入する
ことが，同様に常套手段であるとか，容易になし得たということはできない。
ウ 相違点４に関する容易想到性判断の誤り
引用例２には，試験管内で，２６ヌクレオチドから６７ヌクレオチドにおいて，
ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の長さに依存することなく，ＤＮＡが切断されることを示す
結果が開示されている。図３のパネルＡには，２３－８９（６７ヌクレオチド長）の
ｔｒａｃｒＲＮＡと２３－４８（２６ヌクレオチド長）のｔｒａｃｒＲＮＡとの間
で，オリゴヌクレオチドＤＮＡの切断効率が変わらないことが示されている。図５
及び図Ｓ１５には，キメラＡが最小の機能的ｔｒａｃｒＲＮＡを用いて設計され，
この最小の構造が作用に最適化されていることが示されている。
以上のことからは，当業者がｔｒａｃｒＲＮＡを長くする理由はない。
また，引用例２の図Ｓ１４Ａ及びＢにおけるバンドに基づけば，当業者は，３’が
伸張した長いｔｒａｃｒ配列（２３－８９）を有するものよりも，２３－４８の短
いｔｒａｃｒ配列を有するＲＮＡ（２６ヌクレオチド長のキメラＲＮＡに対応する）
の活性の方が高いと認識したはずである。
当業者は，より長いＲＮＡを送達する観点で，大きなＲＮＡ分子は複雑性を増加
させ，潜在的な毒性を増加させることを理解したので，ｔｒａｃｒＲＮＡの長さを
２６ヌクレオチドに減少させてもその強力な活性が維持されたとの点にも鑑みれば，
当業者がｔｒａｃｒＲＮＡの長さを増加させることに着目する理由はない。
〔被告の主張〕
⑴ 本願優先日である平成２４年１２月１２日当時，真核細胞のゲノム編集を行
うために，人工酵素であるジンク－フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）や転写活性
化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用することは，周知であった。し
たがって，当業者には，同様にゲノム編集のツールである引用発明２のＣＲＩＳＰ
Ｒ－Ｃａｓ系を，真核細胞中のゲノムに対して機能させようと試みることに動機付
けがあった。このことは，本願発明の発明者とは異なる少なくとも３つの研究グル
ープが，本願優先日前から，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を真核細胞中のゲノムに対し
て機能させようと試みていたことが示されていることからも裏付けられる。
⑵ 細胞の内部で所望のタンパク質や核酸を機能させようとする場合に，それら
を発現するベクターを用いることは常套手段であり，本願優先日当時，ゲノム編集
のための成分を導入するために，ベクター系を用いることも一般的であった。した
がって，当業者は，適宜，引用発明２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系や組換えテンプレ
ートをベクター系とすることができた。
⑶ 原告らが示す問題点は，いずれも引用発明２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を真
核細胞中のゲノムに対して機能させようと試みる際に生じるおそれのあるものを挙
げているにすぎない。当業者は，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の真核細胞への適用の成
否について，確信までは持てなかったとしても，上記の問題点は，当業者に真核細
胞への適用ができないとの認識を生じさせるほどのものではない。
⑷ 引用例２の記載は，「２６のヌクレオチドの長さ」とするものであるが，こ
の記載から，２３～４８の２６ヌクレオチド長を含むｔｒａｃｒＲＮＡであれば，
その５’末端側や３’末端側にさらにヌクレオチドが存在しても，Ｃａｓ９による
ＤＮＡ切断を誘導できると理解することができる。引用例２には，５’末端側や
３’末端側にヌクレオチドを付加してさらに長くすることを妨げる記載はなく，か
えって，図３Ａには，「１５－５３」「２３－８９」「１５－８９」の領域からな
， ，
るさらに長いｔｒａｃｒＲＮＡも，ｃｒＲＮＡと共に用いることでＣａｓ９による
ＤＮＡ切断を誘導できることが示されている。
そうすると，引用発明２においても，ｔｒａｃｒＲＮＡを３０ヌクレオチド長程
度のものとすることは，当業者において適宜なし得たことというべきである。
第４ 当裁判所の判断
１ 本願発明について
⑴ 本願明細書の記載
本願明細書には，以下の記載がある（甲９）。
ア 技術分野
【０００３】本発明は，一般に，クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）（ＣＲＩＳＰＲ）及びその成分に関す
るベクター系を使用し得る配列ターゲティング，例えば，ゲノム摂動又は遺伝子編
集を含む遺伝子発現の制御に使用される系，方法及び組成物に関する。
イ 背景技術
【０００５】ゲノムシーケンシング技術及び分析法の近年の進歩により，多様な
範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が
顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は，因果的遺伝子変異の
体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため，並びに合成生物学，バイオ
テクノロジー及び医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術，例
えば，デザイナー亜鉛フィンガー，転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ），
又はホーミングメガヌクレアーゼが利用可能であるが，安価で，設定が容易で，ス
ケーラブルで，真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエ
ンジニアリング技術が依然として必要とされている。
ウ 発明が解決しようとする課題
【０００７】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は，単一Ｃａｓ
酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させるこ
とができ，換言すると，Ｃａｓ酵素は，前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮ
Ａ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術及び分析法のレ
パートリーへのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の付加により，多様な範囲の生物学的機能
及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が加速される。
エ 課題を解決するための手段
【００１０】本願発明は，好ましい実施形態において，細胞は真核細胞であり，よ
り好ましい実施形態において，細胞は哺乳動物細胞であり，さらにより好ましい実
施形態において，哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００１２】一態様において，本願発明は，１つ以上のベクターを含むベクター
系を提供する。一部の実施形態において，ＣＲＩＳＰＲ複合体は，真核細胞の核中
の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積をドライブするために十分な強度
の１つ以上の核局在化配列を含む。理論により拘束されるものではないが，核局在
化配列は，真核生物中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性に必要でないが，そのような配列
を含めることにより，特に核中の核酸分子のターゲティングに関して系の活性が向
上すると考えられる。一部の実施形態において，ＣＲＩＳＰＲ酵素は，ＩＩ型ＣＲ
ＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において，ＣＲＩＳＰＲ酵素は，Ｃａｓ９
酵素である。一部の実施形態において，Ｃａｓ９酵素は，肺炎連鎖球菌
（ S.pneumoniae ） 化 膿 性 連 鎖 球 菌 （ S.pyogenes ） 又 は Ｓ ． サ ー モ フ ィ ラ ス
， ，
（S.thermophilus）Ｃａｓ９であり，それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を
含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は，真核細胞中の発現のためにコドン最適化されてい
る。
【００１４】用語「調節エレメント」は，プロモーター，エンハンサー，内部リボ
ソーム進入部位（ＩＲＥＳ），及び他の発現制御エレメント（例えば，転写終結シグ
ナル，例えば，ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列）を含むものとする。
一部の実施形態において，ベクターは，１つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーター(‥)，
１つ以上のｐｏｌＩＩプロモーター（‥），１つ以上のｐｏｌＩプロモーター（‥）
又はそれらの組合せを含む。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例としては，限定される
ものではないが，Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモータ
ーの例としては，限定されるものではないが，レトロウイルスのラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（‥），サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモー
ターが挙げられる。用語「調節エレメント」により，エンハンサーエレメント，例え
ば，ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲ中のＲ－Ｕ５’セグメン
ト；ＳＶ４０エンハンサー；も包含される。ベクターを宿主細胞中に導入し，それに
より本明細書に記載の核酸によりコードされる転写物，融合タンパク質又はペプチ
ドを含むタンパク質，又はペプチドを産生することができる。
【００１５】有利なベクターとしては，レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス
が挙げられ，そのようなベクターのタイプは，特定のタイプの細胞のターゲティン
グのために選択することもできる。
【００２４】本発明の態様は，内因性ゲノム中の部位特異的遺伝子ノックアウト
を包含した：本発明は，亜鉛フィンガー及びＴＡＬエフェクターをベースとする部
位特異的ヌクレアーゼ技術の使用と比べて有利である。それというのも，これは複
雑な設計を要求せず，これを使用して同一ゲノム内の複数の遺伝子を同時にノック
アウトすることができるためである。さらなる態様において，本発明は，部位特異
的ゲノム編集を包含する。本発明は，天然又は人工部位特異的ヌクレアーゼ又はリ
コンビナーゼの使用と比べて有利である。それというのも，これは部位特異的二本
鎖切断を導入してターゲティングされるゲノム遺伝子座における相同組換えを促進
し得るためである。
オ 発明を実施するための形態
【００５３】一般に，
「ＣＲＩＳＰＲ系」は，集合的に，ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａ
ｓ」）遺伝子の発現又はその活性の指向に関与する転写物及び他のエレメント，例と
して，Ｃａｓ遺伝子をコードする配列，ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）
配列（例えば，ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ），ｔｒａｃｒメイ
ト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲ
ＮＡによりプロセシングされる部分ダイレクトリピートを包含），ガイド配列（内因
性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される），又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子
座からの他の配列及び転写物を指す。
一部の実施形態において，ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは，内因性Ｃ
ＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物，例えば，化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）
に由来する。一般に，ＣＲＩＳＰＲ系は，標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して
プロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエ
レメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して，
「標的配列」は，ガイ
ド配列が相補性を有するように設計される配列を指し，標的配列とガイド配列との
間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。
標的配列を含むターゲティングされる遺伝子座中への組換えに使用することがで
きる配列又はテンプレートは，「編集テンプレート」又は「編集ポリヌクレオチド」
又は「編集配列」と称される。本発明の態様において，外因性テンプレートポリヌク
レオチドを編集テンプレートと称することができる。本発明の一態様において，組
換えは，相同組換えである。
【００５４】理論により拘束されるものではないが，ｔｒａｃｒ配列は，野生型
ｔｒａｃｒ配列の全部又は一部（例えば，野生型ｔｒａｃｒ配列の約又は約２０，
２６，３２，４５，４８，５４，６３，６７，８５，又はそれよりも多い数を超える
ヌクレオチド）を含み得，又はそれからなっていてよく，例えば，ガイド配列に作動
可能に結合しているｔｒａｃｒメイト配列の全部又は一部とのｔｒａｃｒ配列の少
なくとも一部に沿うハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形
成し得る。
【００６３】一般に，ｔｒａｃｒメイト配列は，
（１）対応するｔｒａｃｒ配列を
含有する細胞中でｔｒａｃｒメイト配列によりフランキングされているガイド配列
の切り出し；及び（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ
複合体は，ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列を含む）
の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列
を含む。一部の実施形態において，ｔｒａｃｒ配列は，約又は約５，６，７，８，９，
１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２５，３０，
４０，５０，又はそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施
形態において，ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｔメイト配列は，単一転写物内に含有
され，その結果，２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造，例えば，ヘアピン
を有する転写物を産生する。ヘアピン構造において使用される好ましいループ形成
配列は，４ヌクレオチド長であり，最も好ましくは，配列ＧＡＡＡを有する。しかし
ながら，代替配列であり得るようにより長い又は短いループ配列を使用することが
できる。配列は，好ましくは，ヌクレオチドトリプレット（例えば，ＡＡＡ），及び
追加のヌクレオチド（例えば，Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例としては，Ｃ
ＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。本発明の一実施形態において，転写物又は転写
されるポリヌクレオチド配列は，少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好まし
い実施形態において，転写物は，２，３，４又は５つのヘアピンを有する。本発明の
別のさらなる実施形態において，転写物は，多くとも５つのヘアピンを有する。一
部の実施形態において，単一転写物は，転写終結配列をさらに含み；好ましくは，こ
れはポリＴ配列，例えば，６つのＴヌクレオチドである。このようなヘアピン構造
の例示的説明を，図１１Ｂ（別紙１のとおり）の下方位置に提供し，最後の「Ｎ」及
びループの上流の５’側の配列の部分は，ｔｒａｃｒメイト配列に対応し，ループ
の３’側の配列の部分は，ｔｒａｃｒ配列に対応する。
カ 実施例
(ア) 実施例１：真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性
【０１４５】図２は，本実施例に記載の細菌ＣＲＩＳＰＲ系を説明する。図２Ａ
は，化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＳＦ３７０からのＣＲＩＳＰＲ遺
伝子座１及びこの系によるＣＲＩＳＰＲ媒介ＤＮＡ開裂の提案される機序を示す模
式図を説明する。‥図２Ｂは，化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ
９）及びＲＮアーゼＩＩＩ（ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ）の，哺乳動物核中への輸送を可
能とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）によるエンジニアリングを説明する。
(イ) 実施例４：複数のキメラｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの評
価
【０１５９】本実施例は，異なる長さの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を取り込む
ｔｒａｃｒ配列を有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ；ガイド配列，ｔｒａｃｒメ
イト配列，及びｔｒａｃｒ配列を単一転写物中で含む）について得られた結果を記
載する。
Ｃａｓ９はＣＢｈプロモーターによりドライブされ，キメラＲＮＡはＵ６プロモ
ーターによりドライブされる。
ガイド及びｔｒａｃｒ配列は，ｔｒａｃｒメイト配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ
と，それに続くループ配列ＧＡＡＡにより離隔している。ヒト遺伝子座ＥＭＸ１及
びＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲ
アッセイの結果を，それぞれ図１６ｂ及び１６ｃ（別紙１のとおり）に説明する。
ｃｈｉＲＮＡをそれらの「＋ｎ」表記により示し，ｃｒＲＮＡは，ガイド及びｔｒ
ａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。トリプリ
ケートで実施されたこれらの結果の定量を，図１７ａ及び１７ｂ（別紙１のとおり）
にヒストグラムにより示し，それぞれ図１６ｂ及び１６ｃに対応する（「Ｎ．Ｄ．」
は，インデルが検出されなかったことを示す）。
【０１６２】最初に，ヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のＥＭＸ１遺伝子座内の３つ
の部位をターゲティングした。それぞれのｃｈｉＲＮＡのゲノム改変効率は，ＤＮ
Ａ二本鎖切断（ＤＳＢ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ損傷修復経路による
その後続の修復から生じる突然変異を検出するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッ
セイを使用して評価した。ｃｈｉＲＮＡ（＋ｎ）と表記される構築物は，野生型ｔｒ
ａｃｒＲＮＡの最大＋ｎ個のヌクレオチドがキメラＲＮＡ構築物中に含まれること
を示し，ｎについては４８，５４，６７，及び８５の値が使用される。野生型ｔｒａ
ｃｒＲＮＡのより長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）及び
ｃｈｉＲＮＡ（＋８５））は，３つ全てのＥＭＸ１標的部位におけるＤＮＡ開裂を媒
介し，特にｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は，ガイド及びｔｒａｃｒ配列を別個の転写物中
で発現する対応するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドよりも顕著に高い
レベルのＤＮＡ開裂を実証した（図１６ｂ及び１７ａ）。ハイブリッド系（別個の転
写物として発現されるガイド配列及びｔｒａｃｒ配列）を検出可能な開裂を生じな
かったＰＶＡＬＢ遺伝子座中の２つの部位も，ｃｈｉＲＮＡを使用してターゲティ
ングした。ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）及びｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は，２つのＰＶＡＬ
Ｂプロトスペーサーにおける顕著な開裂を媒介し得た（図１６ｃ及び１７ｂ）。
ＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的について，ｔｒａｃｒ配列
長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察された。いかなる理論によ
っても拘束されるものではないが，ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端により形成される
二次構造は，ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の比率の向上における役割を担い得る。
⑵ 本願発明の特徴
本願発明は，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターを用いたゲノム編集技術に関する発
明である。
本願発明においては，短鎖ＲＮＡ分子（ガイド配列，ｔｒａｃｒＲＮＡ配列，及び
ｔｒａｃｒメイト配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ポリ－ヌクレオチド配列）に
より，Ｃａｓ酵素（ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質）に，真核細胞中の特異的ＤＮＡ標的
（ポリヌクレオチド遺伝子座）を認識させ，前記Ｃａｓ酵素が前記ＤＮＡ標的を開
裂し，それにより，前記ＤＮＡ標的が改変する。
本願発明は，ａ）前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ポリ－ヌクレオチド配列をコード
するヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント，及び，ｂ）
前記ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合し
ている第２の調節エレメント，が１つ以上の同じ又は異なるベクター上に位置し，
前記ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み，前記ｔｒａ
ｃｒ配列が３０以上のヌクレオチドの長さを有すること，を要件とする。
このうち，ガイド配列の長さに関する構成（ｔｒａｃｒ配列が３０以上のヌクレ
オチドの長さを有すること）に関しては，本願明細書に，短鎖ＲＮＡ分子として，異
なる長さの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が取り込まれたキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮ
Ａ；ガイド配列，ｔｒａｃｒメイト配列，及びｔｒａｃｒ配列を単一転写物中で含
む）とＣａｓ９酵素を使用した実験結果が記載され，野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのよ
り長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）及びｃｈｉＲＮＡ（＋
８５）が，３つ全てのＥＭＸ１標的部位におけるＤＮＡ開裂を媒介し（図１６ｂ及
び１７ａ） ２つのＰＶＡＬＢプロトスペーサーにおいても顕著な開裂を媒介してお
，
り（図１６ｃ及び１７ｂ），ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴ってゲノム改変効率が増
加することなどが示されている（実施例４）。
２ 取消事由１（引用発明１に基づく特許法２９条の２の判断の誤り）について
⑴ 引用例１の記載（甲１の１。なお，段落番号は，国内公表公報である特表２０
１６－５０２８４０号公報（甲１の２）の段落番号である。
【０１５１】は，引用例
１の優先基礎明細書（甲１０５）による。）
ア 技術分野
【０００１】本発明は，標的ゲノム修飾に関する。特に，本発明は，ＲＮＡ誘導型
エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質を含む融合タンパク質，
及び標的染色体配列を修飾又は調節するための該タンパク質の使用方法に関する。
イ 背景技術
【０００２】標的ゲノム修飾は，真核細胞，胚及び動物の遺伝子操作のための強
力なツールである。現在の方法は，例えば，ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦ
Ｎ）又は転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のよう
な人工ヌクレアーゼの使用に依存している。しかしながら，それぞれの新規ゲノム
標的は，新規の配列特異的ＤＮＡ結合分子を含む新規ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮの設計
を必要とする。したがって，これらのカスタム設計されたヌクレアーゼは，割高な
費用が掛かり，製造に時間を要する傾向がある。さらに，ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの
特異性は，それらがオフターゲット(‥)の切断を仲介し得る程度のものである。
【０００３】したがって，それぞれの新しい標的ゲノム部位に対する新しいヌク
レアーゼの設計を必要としない標的ゲノム修飾技術‥，オフターゲット作用が殆ど
又は全くない，向上した特異性を有する技術が必要とされている。
ウ 発明の概要
【０００４】本開示の種々の面には，単離されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアー
ゼの提供であって，該エンドヌクレアーゼが，少なくとも１つの核局在化シグナル，
少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン，及び切断のために特定のヌクレオチド配
列にエンドヌクレアーゼを標的化するガイドＲＮＡと相互作用する少なくとも１つ
のドメインを含む，エンドヌクレアーゼの提供が含まれる。
他の態様において，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列は，
プロモーター調節配列に操作可能に連結されていてよく，要すれば，ベクターの一
部であってよい。他の態様において，プロモーター調節配列に操作可能に連結され
ていてよいＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする配列を含むベクターはま
た，プロモーター調節配列に操作可能に連結されていてよいガイドＲＮＡをコード
する配列も含み得る。
【請求項１３】真核細胞又は胚において染色体配列を修飾するための方法であっ
て，／ａ）真核細胞又は胚に，
（ⅰ）少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少な
くとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ，又は少なくとも１つの核局在化シ
グナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸，
（ⅱ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ又は少なくとも１つのガイドＲＮＡをコード
するＤＮＡ，及び任意に， ⅲ）
（ 少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入し，
／ｂ）真核細胞又は胚を，各ガイドＲＮＡが，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを
染色体配列中の標的部位へ誘導し，そこでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが，該
標的部位にて二本鎖の切断を誘導し，該二本鎖の切断が，染色体配列が修飾される
ようにＤＮＡ修復過程により修復されるように培養することを含む，／方法。
【請求項１４】ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質に由来す
る，請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸がｍＲＮＡで
ある，請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸がＤＮＡであ
る，請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】ＤＮＡが，ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含むベクター
の一部である，請求項１６に記載の方法。
【０００５】本発明の別の面は，真核細胞又は胚において染色体配列を修飾する
ための方法を包含する。該方法は，真核細胞又は胚に，
（ｉ）本明細書に記載の，少
なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌク
レアーゼ又は少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸，
（ⅱ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ又は少なくとも１つのガイドＲＮＡをコード
するＤＮＡ，及び要すれば，
（ⅲ）ドナー配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌ
クレオチド，を導入することを含む。該方法はさらに，細胞又は胚を，各ガイドＲＮ
Ａが，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列中の標的部位に誘導され，そ
こでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが，標的部位に二本鎖の切断を導入し，二本
鎖の切断が，染色体配列が修飾されるようなＤＮＡ修復過程により修復されるよう
に培養することを含む。一態様において，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは，Ｃ
ａｓ９タンパク質に由来し得る。別の態様において，細胞又は胚に導入されている
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸は，ｍＲＮＡであり得る。さら
なる態様において，細胞又は胚に導入されているＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
をコードする核酸はＤＮＡであり得る。さらなる態様において，ＲＮＡ誘導型エン
ドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは，ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含
むベクターの一部であり得る。
エ 発明を実施するための形態
【００１４】一態様において，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは，ＩＩ型ＣＲ
ＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である。特定の態様において，ＲＮＡ誘導型エンド
ヌクレアーゼは，Ｃａｓ９タンパク質に由来する。
【００２２】任意の態様において，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは，ガイド
ＲＮＡを含むタンパク質－ＲＮＡ複合体の一部であり得る。ガイドＲＮＡは，ＲＮ
Ａ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用し，エンドヌクレアーゼを，特定の標的部
位（ガイドＲＮＡ塩基対の５’末端にある特定のプロトスペーサー配列）へ誘導す
る。
【００６０】任意のドナーポリヌクレオチドが存在する態様において，ドナーポ
リヌクレオチドにおけるドナー配列は，二本鎖の切断の修復中に標的部位において
染色体配列で置換されるか，又は染色体配列中に挿入され得る。例えば，ドナー配
列が，染色体配列中の標的部位の上流及び下流配列のそれぞれと実質的に同一の配
列を有する上流及び下流配列に挟まれている態様において，該ドナー配列は，相同
組換え修復過程により仲介される修復中に標的部位において染色体配列で置換され
るか，又は染色体配列に挿入され得る。
(ア) ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
【００６３】本方法は，細胞又は胚に，少なくとも１つの核局在化シグナルを含
む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ又は少なくとも１つの核局在
化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする
核酸を導入することを含む。
【００６４】ある態様において，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは，細胞又は
胚に単離されたタンパク質として導入されてよい。他の態様において，ＲＮＡ誘導
型エンドヌクレアーゼは，細胞又は胚にｍＲＮＡ分子として導入され得る。さらに
他の態様において，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは，細胞又は胚にＤＮＡ分子
として導入され得る。ＤＮＡ配列は直鎖であってよく，又はＤＮＡ配列はベクター
の一部であってよい。
(イ) ガイドＲＮＡ
【００６６】本方法は，また，細胞又は胚に，少なくとも１つのガイドＲＮＡ又は
少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することも含む。ガイド
ＲＮＡは，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用して，エンドヌクレアーゼ
を，染色体配列中の特定のプロトスペーサー配列を有するガイドＲＮＡ塩基対の５’
末端である特定の標的部位へ導く。
【００６７】各ガイドＲＮＡは，３つの領域：染色体配列中の標的部位に相補的
である５’末端における第一の領域，ステムループ構造を形成する第二の内部領域
及び本質的に一本鎖のままである第三の３’領域を含む。‥第一の領域は，各ガイ
ドＲＮＡが融合タンパク質を特定の標的部位へ誘導するように異なっている。‥第
二及び第三の領域は，全てのガイドＲＮＡで同じであってよい。
【００６８】ガイドＲＮＡの第一の領域は，ガイドＲＮＡの第一の領域が標的部
位と塩基対を形成し得るように，染色体配列中の標的部位で配列（すなわち，プロ
トスペーサー配列）に相補的である。例示的態様において，ガイドＲＮＡの第一の
領域は，約１９，２０又は２１のヌクレオチド長である。
【００６９】ガイドＲＮＡは，また，二次構造を形成する第二の領域を含む。ある
態様において，該二次構造は，ステム（又はヘアピン）及びループを含む。例えば，
ループは，約３から約１０ヌクレオチド長の範囲であってよく，ステムは，約６か
ら約２０塩基対長であってよい。したがって，第二の領域の全体の長さは，約１６
から約６０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例示的態様において，ループは，約
４ヌクレオチド長であり，ステムは，約１２塩基対を含む。
【００７０】ガイドＲＮＡは，また，本質的に一本鎖のままである第三の領域を
３’末端に含む。したがって，第三の領域は，目的の細胞内の染色体配列に相補性を
有しておらず，ガイドＲＮＡの残りの部分に相補性を有していない。第三の領域の
長さは可変である。一般的に，第三の領域は，約４ヌクレオチド長以上である。例え
ば，第三の領域の長さは，約５から約６０ヌクレオチド長の範囲である。
【００７１】ガイドＲＮＡの第二及び第三領域の合わせた長さは，約３０から約
１２０ヌクレオチド長の範囲であり得る。一面において，ガイドＲＮＡの第二及び
第三領域を合わせた長さは，約７０から約１００ヌクレオチド長の範囲である。
【００７２】ある態様において，ガイドＲＮＡは，全ての３つの領域を含む単一
分子からなる。他の態様において，ガイドＲＮＡは，２つの別個の分子を含み得る。
第一のＲＮＡ分子は，ガイドＲＮＡの第一の領域及びガイドＲＮＡの第二の領域の
“ステム”の半分を含んでいてよい。第二のＲＮＡ分子は，ガイドＲＮＡの第二の
領域の“ステム”の他の半分及びガイドＲＮＡの第三の領域を含んでいてよい。し
たがって，この態様において，第一及び第二のＲＮＡ分子はそれぞれ，互いに相補
的なヌクレオチド配列を含む。例えば，一態様において，第一及び第二のＲＮＡ分
子はそれぞれ，他の配列と塩基対をつくって機能的ガイドＲＮＡを形成する配列（約
６から約２０ヌクレオチド）を含む。
【００７３】ガイドＲＮＡは，ＲＮＡ分子として細胞又は胚に導入され得る。
【００７４】他の態様において，ガイドＲＮＡは，ＤＮＡ分子として細胞又は胚
に導入され得る。かかる場合において，ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは，目的
の細胞又は胚においてガイドＲＮＡを発現させるためにプロモーター調節配列に操
作可能に連結されていてよい。例示的態様において，配列をコードするＲＮＡは，
マウス又はヒトＵ６プロモーターに連結されている。
【００７５】ある態様において，ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は，ベク
ターの一部であり得る。好適なベクターには，プラスミドベクター及びウイルスベ
クターが含まれる。
【００７６】ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの両方がＤＮＡ
分子として細胞に導入される態様において，それぞれが，別個の分子の一部である
か又は両方が同じ分子の一部であってよい。
(ウ) 標的部位
【００７７】ガイドＲＮＡと結合させたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは，染
色体配列中の標的部位に導かれ，そこで，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは，染
色体配列中に二本鎖の切断を導入する。
(エ) 任意のドナーポリヌクレオチド
【００８５】標的染色体配列と配列類似性を有する上流及び下流配列を含むドナ
ーポリヌクレオチドは，直鎖又は環状であり得る。ドナーポリヌクレオチドが環状
である態様において，それは，ベクターの一部であり得る。例えば，ベクターは，プ
ラスミドベクターであり得る。
【００８８】典型的に，ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡであり得る。ＤＮＡは，
一本鎖若しくは二本鎖及び／又は直鎖若しくは環状であり得る。ドナーポリヌクレ
オチドは，ＤＮＡプラスミド，細菌の人工染色体（ＢＡＣ），酵母の人工染色体（Ｙ
ＡＣ） ウイルスベクター，
， ＤＮＡの直鎖状断片，ＰＣＲフラグメント， （naked）
裸の
核酸，又はリポソーム又はポロキサマーのような送達ビークルと複合体を形成した
核酸であり得る。ある態様において，ドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドは，
プラスミドベクターの一部であり得る。これらの状況のいずれかにおいて，ドナー
配列を含むドナーポリヌクレオチドは，少なくとも１つのさらなる配列をさらに含
み得る。
(オ) 実施例１：哺乳動物発現のためのＣａｓ９遺伝子の修飾
【０１３８】化膿性連鎖球菌株ＭＧＡＳ１５２５２（受託番号ＹＰ＿００５３８
８８４０．１）由来のＣａｓ９遺伝子を，哺乳動物細胞におけるその翻訳を強化す
るためにヒトのコドンで優先的に最適化した。Ｃａｓ９遺伝子は，また，哺乳動物
細胞の核に該タンパク質を標的化するためにＣ末端に核局在化シグナルＰＫＫＫＲ
ＫＶ（配列番号１）を付加することにより修飾された。
【０１４０】修飾されたＣａｓ９ＤＮＡ配列を，哺乳動物細胞における構成的発
現のために，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に置いた。修飾
されたＣａｓ９ ＤＮＡ配列は，また，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ
でのｍＲＮＡ合成のためにＴ７プロモーターの制御下に置いた。
(カ) 実施例２：Ｃａｓ９のターゲティング
【０１４１】アデノ随伴ウイルス挿入部位１（ＡＡＶＳ１）遺伝子座を，Ｃａｓ９
仲介性ヒトゲノム修飾のための標的として用いた。ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座は，タ
ンパク質ホスファターゼ１，調節サブユニット１２Ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のイン
トロン１（４４２７ｂｐ）に位置する。
【０１４３】Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは，ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするた
めに設計された。標的認識配列（すなわち，標的配列の非コーディング鎖に相補的
な配列）及びプロトスペーサー配列を含む４２ヌクレオチドのＲＮＡ（本明細書中
“ｃｒＲＮＡ”配列という。（５’から３’；ｃｒＲＮＡの３’配列に相補的な５’
） ）
配列及び付加的ヘアピン配列を含む８５ヌクレオチドのＲＮＡ（本明細書中“ｔｒ
ａｃｒＲＮＡ”配列という。；並びに，ｃｒＲＮＡのヌクレオチド１－３２，ＧＡＡ
）
Ａループ及びｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド１９－４５を含むキメラＲＮＡを調
製した。キメラＲＮＡコーディング配列はまた，ヒト細胞におけるインビボ転写の
ためのヒトＵ６プロモーターの制御下に置いた。
【０１４４】【表８】（別紙２のとおり）
(キ) 実施例３：ゲノム修飾をモニターするためのドナーポリヌクレオチドの調製
【０１４５】ＰＰＰ１Ｒ１２ＣのＮ末端へのＧＦＰタンパク質の特異的挿入を，
Ｃａｓ９仲介性ゲノム修飾をモニターするために用いた。相同組換えによる挿入を
仲介するために，ドナーポリヌクレオチドを調製した。ＡＡＶＳ１－ＧＦＰ ＤＮＡ
ドナーは，５’
（１１８５ｂｐ）のＡＡＶＳ１遺伝子座の相同アーム，ＲＮＡスプラ
イシング受容体，ターボＧＦＰコーディング配列，３’転写ターミネーター及び３’
（１２１７ｂｐ）のＡＡＶＳ１遺伝子座の相同アームを含んでいた。
【０１４７】特異的遺伝子導入は，ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの最初の１０７アミノ酸と
ターボＧＦＰの融合タンパク質をもたらし得る。予期される融合タンパク質は，Ｐ
ＰＰ１Ｒ１２Ｃの第一エクソンと設計されたスプライス受容体の間のＲＮＡスプラ
イシングからＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの最初の１０７アミノ酸残基（網掛け灰色部分）を
含む（‥）。
(ク) 実施例４：Ｃａｓ９仲介性特異的導入
【０１４９】トランスフェクションをヒトＫ５６２細胞で行った。Ｋ５６２細胞
株を American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手し，１０％ＦＢＳ及び
２ｍＭのＬ－グルタミンを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地中で増殖させた。
培養物をトランスフェクションの１日前に（１ｍＬ当たり約５０万個の細胞で）分
割した。細胞を，Ｔ－０１６プログラムを用いて Nucleofector Lonza） Nucleofector
（ の
ソリューションＶ（Lonza）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョン処理を表７に詳述する。
【０１５０】【表７】（別紙２のとおり）
【０１５１】蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）をトランスフェクションの４日後
に行った。ＦＡＣＳデータを図４（別紙２のとおり）に示す。４つの実験処理群（Ａ
－Ｄ）のそれぞれで検出されたＧＦＰの割合は，対照処理群（Ｅ，Ｆ）よりも多かっ
た（甲１０５）。
(ケ) 実施例５：標的組換えのＰＣＲ確認
【０１５２】ゲノムＤＮＡを，トランスフェクションの１２日後に GenElute
Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit（Sigma）を用いてトランスフェクション細胞
から抽出した。その後，ゲノムＤＮＡを，ＡＡＶＳ１－ＧＦＰプラスミドドナーの
５’相同アームの外側に位置するフォワードプライマー及びＧＦＰの５’領域に位
置するリバースプライマーを用いて，ＰＣＲ増幅させた。フォワードプライマーは，
５’－ＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＣＴＣＴ－３’ 配列番号１８）
（ であり，
リバースプライマーは，５’－ＧＣＧＧＣＡＣＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡ－３’
（配列番
号１９）であった。ジャンクションＰＣＲから予期されるフラグメントサイズは，
１３ ８８ｂｐであった。増幅を，以下のサイクル条件を用いて JumpStart Taq
ReadyMix（Sigma）を用いて行った：最初の変性のために９８℃で２分間；９８℃で
１５秒間，６２℃で３０秒間，及び７２℃で１分３０秒を３５サイクル；そして，最
後の伸張を７２℃で５分間。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離した。
【０１５３】アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を用いて転写された
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（１０μｇ），０．３ｎｍｏｌのプレアニーリングされたｃｒＲ
ＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡの二本鎖，及び１０μｇのＡＡＶＳ１－ＧＦＰ プラスミ
ドＤＮＡをトランスフェクトされた細胞は，予期されたサイズのＰＣＲ産物を示し
た（図５のレーンＡを参照のこと）。
⑵ 引用例１の記載のまとめ及び本件審決が認定した引用発明１
ア 引用例１には，ゲノム編集技術として，ガイドＲＮＡにより誘導されるＲＮ
Ａ誘導型エンドヌクレアーゼを提供することを主な目的とし，これによれば，従来
のゲノム編集技術であるＺＦＮ又はＴＡＬＥＮのように，標的ゲノム部位に対する
新しいヌクレアーゼの設計を要せず，特異性にも優れる技術が記載されている（【０
００１】～【０００４】。
）
イ 具体的には，⑴真核細胞に核局在化シグナルを含むＲＮＡ誘導型エンドヌク
レアーゼ（Ｃａｓ９タンパク質）を導入すること，⑵ガイドＲＮＡがＲＮＡ誘導型
エンドヌクレアーゼを標的部位に誘導すること及び⑶真核細胞において，ＲＮＡ誘
導型エンドヌクレアーゼが標的部位に二本鎖の切断を導入し，ドナーＤＮＡにより
標的部位の染色体配列が修飾されることが記載されている（【請求項１３】【請求項
，
１４】【０００５】。
， ）
このうち，⑴のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを真核細胞に導入する方法とし
て，①タンパク質を導入する方法，②タンパク質をコードするｍＲＮＡを導入する
方法及び③タンパク質をコードするＤＮＡをベクターの一部にして導入する方法が
開示されている（【請求項１５～１７】【０００５】【００６４】。
， ， ）
また，⑵のガイドＲＮＡを真核細胞に導入する方法として，①単一分子（キメラ
ＲＮＡの一本鎖）を導入する方法及び②２つの別個の分子（ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃ
ｒＲＮＡの二本鎖）を導入する方法が開示され 【００７２】 実施例２，
（ ， 実施例４），
③上記①又は②のＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖）をコードするＤＮＡをベクターの一
部にして導入する方法が開示されている（【００７４】【００７５】。
， ）
さらに，⑶のドナーＤＮＡについては，ベクターの一部にして真核細胞に導入す
ることが開示されている（【００８５】【００８８】。
， ）
そして，上記⑴から⑶の調製方法は，実施例１～３に記載されている。
ウ 実施例４及び５においては，⑴及び⑵の導入方法を変更した処理Ａ（⑴②，
⑵②），処理Ｂ及びＣ（⑴①，⑵①）並びに処理Ｄ（⑴③，⑵③）について，対照処
理群（Ｅ，Ｆ）と対比して，蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
（実施例４），ＰＣＲ試
験（実施例５）を用いて，真核細胞の染色体配列の修飾の有無が確認されている。な
お，処理ＡないしＤのうち，処理ＡないしＣはベクター系ではなく，処理Ｄのみが
ベクター系である。
エ 本件審決は，引用例１から前記第２の３⑵のとおり引用発明１を認定した。
⑶ 引用発明１の認定
ア 引用例１には，標的ゲノム編集に関する発明が記載されている 【０００１】
（ ）
ところ，その発明につき，真核細胞又は胚に，少なくとも１つの核局在化シグナル
を含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ，又は少なくとも１つの
核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコー
ドする核酸を導入することを含み（【請求項１３】【０００５】，このうちＲＮＡ誘
， ）
導型エンドヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質に由来し（【請求項１４】 【０００
，
５】，ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸がＤＮＡであり，ＤＮＡ
）
がガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含むベクターの一部である（【請求項１
６】【請求項１７】【００７５】
， ， ）という構成が記載され，ＲＮＡ誘導型エンドヌク
レアーゼをコードする核酸配列がプロモーター調節配列に操作可能に連結され，ベ
クターの一部となっている（【０００４】）という構成も記載されている。
よって，引用例１には，
「少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１
つのⅠⅠ型Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモー
ター調整配列を含むベクター」が記載されている。
イ 引用例１には，その発明につき，真核細胞又は胚に，少なくとも１つのガイ
ドＲＮＡ又は少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することを
含み 【請求項１３】
（ ，
【０００５】，
） このうちガイドＲＮＡが３つの領域，すなわち，
染色体配列中の標的部位に相補的である５’末端における第一の領域，ステムルー
プ構造を形成する第二の内部領域及び本質的に一本鎖のままである第三の３’領域
を含み（【００６７】，目的の細胞又は胚においてガイドＲＮＡを発現させるために
）
プロモーター調節配列に操作可能に連結され（【００７４】，ガイドＲＮＡをコード
）
するＤＮＡ配列がベクターの一部である（【００７５】）構成が記載されている。
よって，引用例１には，
「真核細胞中の染色体配列中の標的部位に相補的である５’
末端における第一の領域，ステムループ構造を形成する第二の内部領域，及び本質
的に一本鎖のままである第三の３’領域を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡをコ
ードするＤＮＡに操作可能に連結されたプロモーター調節配列を含むベクター」が
記載されている。
ウ 引用例１には，その発明が「ベクター系」であることが記載されている。
エ 引用例１には，その発明につき，真核細胞又は胚を，各ガイドＲＮＡが，ＲＮ
Ａ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列中の標的部位へ誘導し，そこでＲＮＡ誘
導型エンドヌクレアーゼが，該標的部位にて二本鎖の切断を誘導し，該二本鎖の切
断が，染色体配列が修飾されるようにＤＮＡ修復過程により修復されるように培養
するという機能を有することが記載されている（【請求項１３】【０００５】。
， ）
よって，引用例１には，
「前記ガイドＲＮＡが，ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を真核
細胞中の染色体配列中の標的部位へ誘導し，そこで該ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質が，
該標的部位にて染色体ＤＮＡ二本鎖の切断を誘導し，該二本鎖の切断が，染色体配
列が修飾されるようにＤＮＡ修復過程により修復される」が記載されている。
オ 引用例１には，各ガイドＲＮＡが３つの領域を含み，ガイドＲＮＡの第二及
び第三領域の合わせた長さは，約３０から約１２０ヌクレオチド長の範囲であり得
ることが記載されている（【００６７】【００７１】。
， ）
よって，引用例１には，
「前記ガイドＲＮＡの第二及び第三領域の合わせた長さが，
約３０から約１２０ヌクレオチド長の範囲であり」が記載されている。
カ 以上によれば，引用例１には，上記アないしオの構成の記載があるから，本
件審決が認定したとおりの発明（引用発明１）が記載されているものと認められる。
⑷ 本願発明と引用発明１との対比
ア 本願発明は，前記第２の２のとおりであり，構成要件に分説すれば次のとお
りである。
Ａ エンジニアリングされた，天然に存在しないクラスター化等間隔短鎖回分リ
ピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ベ
クター系であって，
Ｂ－ａ 真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズ
する１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌク
レオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって，前記ガイ
ドＲＮＡが，ガイド配列，ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列を含む，第１
の調節エレメント，
Ｂ－ｂ ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に
結合している第２の調節エレメントであって，前記タンパク質が，核局在化シグナ
ル（ＮＬＳ）を含む，第２の調節エレメント
Ｃ を含む１つ以上のベクターを含み，
Ｄ 成分ａ）及びｂ）が，前記系の同じ又は異なるベクター上に位置し，
Ｅ 前記ｔｒａｃｒ配列が，３０以上のヌクレオチドの長さを有し，
Ｆ それによって，前記１つ以上のガイドＲＮＡが，真核細胞中の前記ポリヌク
レオチド遺伝子座を標的とし，前記Ｃａｓ９タンパク質が，前記ポリヌクレオチド
遺伝子座を開裂し，それによって，前記ポリヌクレオチド遺伝子座の配列が，改変
され；
Ｇ 前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記１つ以上のガイドＲＮＡが，いっしょに天
然に存在しない，
Ｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系。
イ 構成要件Ａ（Ｃ）について
(ア) 本願発明は，エンジニアリングされた，天然に存在しないクラスター化等
間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）
（ＣＲＩＳＰ
Ｒ－Ｃａｓ）系である。
他方，引用発明１は，天然に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来
のＣａｓ９タンパク質に，核局在化シグナルを含むなどの改変を行い 【００１４】
（ ，
【００６３】，エンジニアリングされた，天然に存在しないＣａｓ９タンパク質を
）
用いるから，引用発明１のこの部分は，本願発明の構成要件Ａのうちベクター系が
「クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃ
ａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）」のものであるという部分に相当する。
(イ) 本願発明の構成要件Ａのうち「ベクター系」の部分（同Ｃも同じ。）は，引
用発明１の構成「ベクター系」に相当する。
ウ 構成要件Ｂ－ａについて
引用発明１の「真核細胞中の染色体配列中の標的部位に相補的である５’末端に
おける第一の領域」は，本願発明の「ガイド配列」に相当する。
引用発明１の「ステムループ構造を形成する第二の内部領域」と「本質的に一本
鎖のままである第三の３’領域」を合わせた第二及び第三領域は，本願明細書の【０
０６３】における「図１１Ｂの下方位置に提供し，最後の「Ｎ」およびループの上流
の５’側の配列の部分は，ｔｒａｃｒメイト配列に対応し，ループの３’側の配列の
部分は，ｔｒａｃｒ配列に対応する。」の記載からみて，本願発明の「ｔｒａｃｒＲ
ＮＡ配列」及び「ｔｒａｃｒメイト配列」に「ループ」を加えた配列に相当する。
そうすると，引用発明１の「真核細胞中の染色体配列中の標的部位に相補的であ
る５’末端における第一の領域，ステムループ構造を形成する第二の内部領域及び
本質的に一本鎖のままである第三の３’領域を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ」
は，本願発明の「ガイド配列，ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列を含む」
「ガイドＲＮＡ」に相当する。
したがって，引用発明１の「（ⅱ）真核細胞中の染色体配列中の標的部位に相補的
である５’末端における第一の領域，ステムループ構造を形成する第二の内部領域，
及び本質的に一本鎖のままである第三の３’領域を含む少なくとも１つのガイドＲ
ＮＡをコードするＤＮＡに操作可能に連結されたプロモーター調節配列を含むベク
ター」は，本願発明の「ａ）真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列に
ハイブリダイズする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする
１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであ
って，前記ガイドＲＮＡが，ガイド配列，ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配
列を含む，第１の調節エレメント」に相当する。
エ 構成要件Ｂ－ｂについて
引用発明１の「プロモーター調整配列」は，本願発明の調節エレメントに相当し，
また，引用発明１は，少なくとも１つの核局在化シグナルを含み，その核局在化シ
グナルは，Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列とともに発現さ
れるものである。
したがって，引用発明１の「（ⅰ）少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少な
くとも１つのＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸に操作可能に連結された
プロモーター調節配列を含むベクター」は，本願発明の「ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している第２の調節エレメン
トであって，前記タンパク質が，核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む，第２の調節エ
レメント」に相当する。
オ 構成要件Ｄについて
引用例１には，
（ｉ）及び（ⅱ）のベクターを，異なるベクターとする態様のほか
に，同じベクターとする態様も記載されている（【０００５】【００８８】
， ）から，本
願発明の構成要件Ｄに相当する。
カ 構成要件Ｆについて
引用発明１は，上記（ｉ）及び（ⅱ）の２つのベクターを構成要素とし，これら２
つのベクターを含むベクター系が，
「ガイドＲＮＡが，ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を
真核細胞中の染色体配列中の標的部位へ誘導し，そこで該ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク
質が，該標的部位にて染色体ＤＮＡ二本鎖の切断を誘導し，該二本鎖の切断が，染
色体配列が修飾されるようにＤＮＡ修復過程により修復される」という機能を備え
るものであるところ，引用発明１の「真核細胞中の染色体配列中の標的部位」「切
，
断」「修飾」は，本願発明の「真核細胞中の前記１つ以上のポリヌクレオチド遺伝子
，
座」「開裂」「改変」にそれぞれ相当する。
， ，
したがって，引用発明１の上記機能は，本願発明が備える「前記１つ以上のガイ
ドＲＮＡが，真核細胞中の前記ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とし，前記Ｃａｓ
９タンパク質が，前記ポリヌクレオチド遺伝子座を開裂し，それによって，前記ポ
リヌクレオチド遺伝子座の配列が，改変され」るのと同じ機能を有するものであり，
構成要件Ｆに相当する。
キ 構成要件Ｇについて
引用発明１は，前記エのとおり，少なくとも１つの核局在化シグナルを含むなど，
天然に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＣａｓ９タンパク質を
改変することで得られたベクターを構成成分とするベクター系であり，また，引用
発明１で用いられているガイドＲＮＡは，第一の領域，第二の内部領域及び第三の
３’領域を含むように人工的に設計されたキメラＲＮＡである。
したがって，引用発明１のベクター系は，本願発明の「前記Ｃａｓ９タンパク質
及び前記１つ以上のガイドＲＮＡが，いっしょに天然に存在しない」ＣＲＩＳＰＲ
－Ｃａｓベクター系に相当する。
ク 構成要件Ｈについて
引用発明１がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系であることは明らかであり，本願
発明の構成要件Ｈに相当する。
ケ 小括
以上によれば，本願発明と引用発明１は，本件審決が認定したとおり（前記第２
の３⑵イ）一致し，次のとおり（同ウ）の相違点を有する。
（相違点）
本願発明は「ｔｒａｃｒ配列が，３０以上のヌクレオチドの長さを有」するもの
であると下限値が特定されているのに対して，引用発明１では，本願発明の「ｔｒ
ａｃｒ配列」に相当する部分の長さについて明確な特定はなく，
「第二及び第三領域」
の合わせた長さが「約３０から約１２０ヌクレオチド長の範囲」である点。
⑸ 相違点の検討
ア 特許法２９条の２は，特許出願に係る発明が，当該特許出願の日前の他の特
許出願又は実用新案登録出願であって，当該特許出願後に特許掲載公報，実用新案
掲載公報の発行がされたものの願書に最初に添付した明細書又は図面（以下「先願
明細書等」という。）に記載された発明又は考案と同一であるときは，その発明につ
いて特許を受けることができないと規定する。
同条の趣旨は，先願明細書等に記載されている発明は，特許請求の範囲以外の記
載であっても，出願公開等により一般にその内容は公表されるので，たとえ先願が
出願公開等をされる前に出願された後願であっても，その内容が先願と同一内容の
発明である以上，さらに出願公開等をしても，新しい技術をなんら公開するもので
はなく，このような発明に特許権を与えることは，新しい発明の公表の代償として
発明を保護しようとする特許制度の趣旨からみて妥当でない，というものである。
同条にいう先願明細書等に記載された「発明」とは，先願明細書等に記載されて
いる事項及び記載されているに等しい事項から把握される発明をいい，記載されて
いるに等しい事項とは，出願時における技術常識を参酌することにより，記載され
ている事項から導き出せるものをいうものと解される。
イ 本願明細書の【０１６２】には，ｔｒａｃｒ配列の長さとゲノム改変効率の
関係について，「ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的について，
ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察された」と
の一般的な説明がなされ，特に，ゲノム改変効率の増加が優れるものとして，ｎが
６７，８５，すなわちｔｒａｃｒ配列の長さが４５，６３のキメラＲＮＡをとりあ
げて，
「野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのより長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲ
ＮＡ（＋６７）及びｃｈｉＲＮＡ（＋８５））は，３つ全てのＥＭＸ１標的部位にお
けるＤＮＡ開裂を媒介し，特にｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は，ガイド及びｔｒａｃｒ配
列を別個の転写物中で発現する対応するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッ
ドよりも顕著に高いレベルのＤＮＡ開裂を実証した（図１６ｂ及び１７ａ）。ハイブ
リッド系（別個の転写物として発現されるガイド配列及びｔｒａｃｒ配列）を検出
可能な開裂を生じなかったＰＶＡＬＢ遺伝子座中の２つの部位も，ｃｈｉＲＮＡを
使用してターゲティングした。ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）及びｃｈｉＲＮＡ（＋８５）
は，２つのＰＶＡＬＢプロトスペーサーにおける顕著な開裂を媒介し得た（図１６
ｃ及び１７ｂ）」との説明が加えられている。
。
そして，本願明細書の図１６や図１７を参照すると，プロトスペーサー１やプロ
トスペーサー３を標的とした場合については，ｎが＋６７，＋８５である場合のみ
ならず，ｎが＋５４，すなわちｔｒａｃｒ配列の長さが３２のキメラＲＮＡである
場合も，ｎが＋４８，すなわちｔｒａｃｒ配列の長さが２６のキメラＲＮＡを上回
る改変効率が得られていることを見て取ることができ，本願発明がｔｒａｃｒ配列
につき３０以上のヌクレオチドの長さに設定したことによって引用発明１とは異な
る新たな効果を奏していることも理解できる。
このように，本願発明は，「ｔｒａｃｒ配列の長さ」に着目し，「ｔｒａｃｒ配列
が，３０以上のヌクレオチドの長さを有」するものという構成を採用したことによ
って，ゲノム改変効率が増加することを特徴とするものである。
他方，引用例１には，ガイドＲＮＡが第一領域から第三領域までの３つの領域を
含むこと（【００６７】，ステムの長さは約６から約２０塩基対長であってよいこと
）
（【００６９】，
） 一般的に，第三の領域は，約４ヌクレオチド長以上であり，例えば，
第三の領域の長さは，約５から約６０ヌクレオチド長の範囲であるとすること（【０
０７０】，ガイドＲＮＡの第二及び第三領域の合わせた長さは，約３０から約１２
）
０ヌクレオチド長の範囲であり得ること（【００７１】）が記載されているにすぎな
い。
ウ また，本願明細書【００６３】の「ループの３’側の配列の部分は，ｔｒａｃ
ｒ配列に対応する」の記載によれば，本願発明のｔｒａｃｒ配列は，引用発明１の
第二領域の片方のステムと第三領域を合わせたものに相当すると認められる。しか
し，引用例１には，ｔｒａｃｒ配列（第二領域の片方のステムと第三領域を合わせ
たもの）の長さそれ自体を規定するという技術思想が表れてはいない。
さらに，本願優先日当時，ｔｒａｃｒ配列の長さを３０以上のヌクレオチドの長
さとするとの当業者の技術常識が存在したことを認めるに足りる証拠はない。
エ よって，引用例１に「ｔｒａｃｒ配列が，３０以上のヌクレオチドの長さを
有」するものという構成を採用したことが記載されているといえないし，技術常識
を参酌することにより記載されているに等しいともいえない。
⑹ 被告の主張について
被告は，２６ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ配列を有するガイドＲＮＡ（＋４８）
と，３２ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ配列を有するガイドＲＮＡ（＋５４）とで，プ
ロトスペーサー２，４及び５を標的としたものでは差異を見出せない（図１６，図
１７）とした上，３０以上のヌクレオチド長と特定する本願発明においては，標的
配列に依存することなく，改変効率が向上するとの効果を有しているとはいえない
として，本願発明は，引用発明１と異なる新たな効果を奏すると認めることはでき
ないと主張する。
しかし，前記のとおり，本願明細書によれば，プロトスペーサー１やプロトスペ
ーサー３という異なる標的配列に対して，３２ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ配列を
有するキメラＲＮＡが，２６ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ配列を有するキメラＲＮ
Ａよりも，ゲノム改変効率が増加していることが記載されており，ｔｒａｃｒ配列
について３０以上のヌクレオチド長であることを特定する本願発明は，プロトスペ
ーサー１やプロトスペーサー３以外においても真核細胞のゲノム改変効率が向上す
る可能性がないということはできない。
したがって，被告の主張は，理由がない。
⑺ 小括
以上のとおり，本件審決において本願発明と引用発明１との一応の相違点として
挙げられた「ｔｒａｃｒ配列が，３０以上のヌクレオチドの長さを有」することは，
実質的な相違点であり，本願発明と引用発明１とが同一の発明であるとは認められ
ないから，本願発明につき特許法２９条の２の規定により特許を受けることができ
ないとした本件審決の判断には誤りがある。
よって，取消事由１は理由がある。
３ 取消事由２（引用発明２に基づく進歩性の判断の誤り）について
⑴ 引用例２の記載（甲２－１・２）
ア 要約
クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃ
ａｓ）系は，侵入する核酸の抑制を誘導するために，ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲ
ＮＡ）を利用するウイルスやプラスミドに対する獲得免疫を，細菌や古細菌に提供
するものである。この系の一部分において，成熟ｃｒＲＮＡが，トランス活性化ｃ
ｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と塩基対を組むことで，標的ＤＮＡに二本鎖切断を
導入するようにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ９を誘導する２つのＲＮＡから
なる構造を形成することを示す。このデュアル－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは，
一本鎖ＲＮＡキメラとして設計されたときも，配列特異的なＣａｓ９による二本鎖
ＤＮＡ切断を誘導する。
私たちの研究は，部位特異的ＤＮＡ切断のためにデュアル－ＲＮＡを使用するエ
ンドヌクレアーゼのファミリーを明らかにし，ＲＮＡでのプログラムが可能なゲノ
ム編集のためにこのシステムを利用する可能性を強調する。
イ 本文８１６頁中欄２５行目～３５行目
ＩＩ型の系において，Ｃａｓ９タンパク質が，標的二本鎖ＤＮＡを切断するため
に，活性化ｔｒａｃｒＲＮＡと標的指向ｃｒＲＮＡの間の塩基対構造を必要とする
酵素ファミリーを構成することを示す。位置特異的切断は，標的であるプロトスペ
ーサーＤＮＡとｃｒＲＮＡの間の塩基対を形成する相補性と，標的ＤＮＡの領域に
並置される短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる］に
より定められる場所で生じる。
ウ 図３（別紙３のとおり）
Ｃａｓ９に触媒される標的ＤＮＡの切断は，ｔｒａｃｒＲＮＡの活性化ドメイン
を必要とし，ｃｒＲＮＡのシード配列により制御される。
（Ａ）Ｃａｓ９－ｔｒａｃ
ｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体は，４２ヌクレオチド長のｃｒＲＮＡ－ｓｐ２と切断
型のｔｒａｃｒＲＮＡ構成体を用いて再構築され，図１Ｂと同様に切断活性につい
てアッセイされた。（中略）（Ｃ）Ｃａｓ９仲介性ＤＮＡ切断を誘導することができ
るｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの最小領域（青い陰が付された領域）。
エ 本文８２０頁左欄５行目～１８行目
標的認識配列を５’末端に含み，その下流にｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの間
に生じる塩基対相互作用を保持するヘアピン構造を含む２つのバージョンのキメラ
ＲＮＡを設計した。プラスミドＤＮＡを用いた切断アッセイにおいて，長い方のキ
メラＲＮＡは，切断ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体を用いた場合に観察され
た場合と同じような挙動でＣａｓ９によるＤＮＡ切断を誘導できることを観察によ
って確認した。
オ 図５（別紙３のとおり）
Ｃａｓ９は，ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの特徴を組み合わせた単一のエンジ
ニアリングされたＲＮＡ分子を使用して，プログラムすることができる。
（Ａ）
（上）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて，Ｃａｓ９は，活性化
しているｔｒａｃｒＲＮＡ及び標的化ｃｒＲＮＡにより形成される２つのＲＮＡ構
造により誘導されて，部位特異的に標的となった二本鎖ＤＮＡを切断する。
（下）ｃｒＲＮＡの３’末端をｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に融合することによ
り生成されたキメラＲＮＡ。
カ 本文（８２０頁右欄２行目～９行目）
ジンク－フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）や転写活性化様エフェクターヌクレ
アーゼ（ＴＡＬＥＮ）は，ゲノムを操作するために設計された人工酵素として，大き
な関心を集めた。私たちは，遺伝子ターゲティングとゲノム編集への応用に向けた
大きな潜在能力をもたらし得るＲＮＡによりプログラムされたＣａｓ９に基づく代
替的な手法を提案する。
キ プ ラ ス ミ ド Ｄ Ｎ Ａ 切 断 ア ッ セ イ （ SUPPLEMENTARY MATERIALS AND
METHODS）
未処理の，あるいは制限酵素処理により鎖状化されたプラスミドＤＮＡ（３００
ｎｇ（～８ｎＭ））は，精製されたＣａｓ９タンパク質（５０－５００ｎＭ）とｔｒ
ａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体（５０－５００ｎＭ，１：１）とともに，Ｃａｓ９
プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＫＣＬ，
０．５ｍＭ ＤＴＴ， １ｍＭ
０． ＥＤＴＡ）中で，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を加えて，
あるいは加えずに，３７℃で６０分間インキュベートした。
ク 標的ＤＮＡとの結合及び切断のためのデュアルＲＮＡの要件（８１８頁左欄
１行目～中欄８行目）
ｔｒａｃｒＲＮＡは，標的ＤＮＡ結合のために，及び／又は標的認識の下流にあ
るＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を刺激するのに必須である可能性がある。ｔｒａｃ
ｒＲＮＡの添加により，Ｃａｓ９と標的ＤＮＡとの結合は実質的に増強されたが，
Ｃａｓ９単独又はＣａｓ９－ｃｒＲＮＡとの特異的ＤＮＡ結合はほとんど観察され
なかった（図Ｓ９）。これは標的ＤＮＡ認識にはｔｒａｃｒＲＮＡが必要であること
を示し，標的ＤＮＡの相補鎖との相互作用には，おそらくｔｒａｃｒＲＮＡがｃｒ
ＲＮＡを適切に方向付ける必要があることを示す。この相互作用により，ｃｒＲＮ
Ａによって配列が異なるｃｒＲＮＡ５’末端の２０個のヌクレオチドが標的ＤＮＡ
に利用できる構造が形成される。ｃｒＲＮＡ塩基対合領域の下流に位置するｔｒａ
ｃｒＲＮＡの大部分は，自由に追加のＲＮＡ構造を形成し，及び／又は，Ｃａｓ９
もしくは標的ＤＮＡ部位と相互作用する。ｔｒａｃｒＲＮＡの全長が部位特異的な
Ｃａｓ９に触媒されるＤＮＡ切断に必要かどうかを決定するために，全長成熟（４
２ヌクレオチド）ｃｒＲＮＡと，５’又は３’末端で配列が欠如した様々な切断型の
ｔｒａｃｒＲＮＡを使用して再構成されたＣａｓ９－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮ
Ａ複合体を試験した。これらの複合体について，短い標的ｄｓＤＮＡを用いて切断
の試験を行った。天然配列のヌクレオチド２３～４８を保持している実質的に切り
縮められたバージョンのｔｒａｃｒＲＮＡは，頑強なデュアルＲＮＡによりガイド
されるＣａｓ９に触媒されるＤＮＡ切断を支持することができた（図３，Ａ及びＣ，
並びに図Ｓ１０，Ａ及びＢ）。
ケ 本文（８２０頁左欄１９行目～２９行目）
短い方のキメラＲＮＡはこのアッセイでは効率的に機能せず，ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ｃｒＲＮＡ塩基対相互作用を超えた５～１２位のヌクレオチドが効率的なＣａｓ９
結合及び／又は標的認識に重要であることが確認された。短いｄｓＤＮＡを基質と
して用いる切断アッセイでも同様の結果が得られ，標的ＤＮＡの切断部位の位置が
二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡをガイドとして用いた場合の観察結果と同一で
あることがさらに示された（図５Ｃ及び図Ｓ１４，Ｂ及びＣ。別紙３のとおり）。
⑵ 引用例２の記載のまとめ
ア キメラＲＮＡ
引用例２には，
「標的認識配列を５’末端に含み，その下流にｔｒａｃｒＲＮＡと
ｃｒＲＮＡの間に生じる塩基対相互作用を保持するヘアピン構造を含む２つのバー
ジョンのキメラＲＮＡを設計した」ことが記載され（前記⑴エ）「プラスミドＤＮ
，
Ａ切断アッセイ」には，標的となるプラスミドＤＮＡ，Ｃａｓ９タンパク質，ＲＮＡ
は，緩衝液中で混合され（前記⑴キ），当該混合により，図５Ａに示されるとおり，
標的認識配列が標的配列にハイブリダイズすることが記載されている（前記⑴オ）。
また，図５ＢのキメラＡには，ｔｒａｃｒＲＮＡが２６ヌクレオチド長であるこ
とが示されている（「３’－」の右側に位置するＧないしＵの２６文字の部分）。
そうすると，引用例２には，
「標的認識配列を５’末端に含み，その下流にｔｒａ
ｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの間に生じる塩基対相互作用を保持するヘアピン構造を含
むキメラＲＮＡであって，前記標的認識配列が緩衝液中で標的配列にハイブリダイ
ズするキメラＲＮＡ」であり「前記ｔｒａｃｒＲＮＡが，２６のヌクレオチドの長
さを有」するものが開示されているものと認められる。
イ ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質
引用例２に，
「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて，Ｃａｓ９は，活性
化しているｔｒａｃｒＲＮＡ及び標的化ｃｒＲＮＡにより形成される２つのＲＮＡ
構造により誘導されて，部位特異的に標的となった二本鎖ＤＮＡを切断する。（前
」
記⑴オ）「デュアル－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは，一本鎖ＲＮＡキメラとし
，
て設計されたときも，配列特異的なＣａｓ９による二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する」
（前記⑴ア）との記載があることからすれば，引用例２には，
「ＩＩ型Ｃａｓ９タン
パク質」が，デュアル－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡやキメラＲＮＡにより誘導
され，「標的配列を開裂する」ものが開示されているものと認められる。
ウ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
引用例２のキメラＲＮＡは，デュアル（二本鎖）－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ
を人工的に一本鎖のキメラに設計したものであるから（前記⑴ア），このキメラＲＮ
Ａを構成成分として含む，「クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）
／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系」は，
「エンジニアリングされた，天然に存在しな
い」
「クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃ
ａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）系」であるということができる。
⑶ 引用発明２及び本願発明との一致点及び相違点
ア 前記⑵によれば，引用例２に開示されている引用発明２は，本件審決が認定
したとおりのもの（前記第１の３⑶ア）であると認められ，本願発明と引用発明２
の一致点及び相違点は，本件審決が認定したとおりのもの（前記第１の３⑶イ，ウ）
であると認められる。
イ 相違点の看過をいう原告らの主張について
(ア) 原告らは，本願発明と引用発明２について相違点５，６を認定した上，更に
その判断をすべきであった旨を主張する。
しかしながら，本願発明は，ａ）ガイド配列，ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒメ
イト配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ポリ－ヌクレオチド配列をコードするヌク
レオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント，及び，ｂ）ＩＩ型
Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している第２
の調節エレメント，を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系であって，核局在化シ
グナルを含むベクター系を対象とするものであり，当該ベクター系の機能として，
①前記ガイド配列が，真核細胞中のポリヌクレオチド遺伝子座を標的にする，②前
記Ｃａｓ９タンパク質が，前記ポリヌクレオチド遺伝子座を開裂する，③上記①，
②によりポリヌクレオチド遺伝子座の配列が改変される，を規定するに止まる。本
願発明は，ａ）及びｂ）に基づいて複合体を形成すること（原告らの主張する相違点
５）や，開裂を行う環境や開裂の対象（同６）について特段定めていないから，これ
らの構成を付加して引用発明２を認定すべき理由はない。
よって，本願発明と引用発明２について相違点５，６を認定すべきであったとの
原告らの主張は理由がない。
(イ) なお，仮に相違点５，６があるものとして考えても，本件審決は，相違点１
の判断において，
「真核細胞の核内のゲノムにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を到達させる
ために，タンパク質を核内に移行させるための常套手段である核局在化シグナルを
Ｃａｓ９タンパク質に付加することは，当業者が格別の創意工夫なくなし得た」と
して，複合体の形成の前提となる，真核細胞の核内にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を送
達することの容易想到性判断を行っている。
また，本件審決は，相違点１の判断において，
「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系も真核細
胞中のゲノムに対して機能させようと試みることは当業者にとって，ごく自然な発
想にすぎない」，相違点３の判断において，「細胞の内部で所望のタンパク質や核酸
を機能させようとする場合に，それらを発現するベクターを用いることは常套手段
である。‥引用発明２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を組換えテンプレートとともに真
核細胞中のゲノムに対して機能させようとすることが十分に動機づけられる以上，
それらを構成する成分，すなわちＣａｓ９タンパク質，キメラＲＮＡ及び組換えテ
ンプレートをベクター系とすることは，当業者が適宜なし得た」とも判断しており，
本願発明と引用発明２において，開裂対象や開裂環境が相違していることを前提と
した容易想到性判断を実質的に行っている。
(ウ) したがって，本願発明と引用発明２について相違点５，６を認定した上，更
にその判断をすべきであった旨をいう原告らの主張は理由がない。
⑷ 相違点４の判断について
ア 引用例２には，全長成熟（４２ヌクレオチド）ｃｒＲＮＡと，５’又は３’末
端で配列が欠如した様々な切断型のｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて再構成された
二本鎖のＣａｓ９－ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体を用いた試験において，
天然配列のヌクレオチド２３～４８（ｔｒａｃｒ配列のヌクレオチド長は２６）を
保持しているｔｒａｃｒＲＮＡがＣａｓ９によるＤＮＡ切断に有効であることが示
されている（前記⑴ウ，ク，図３Ａ）。
また，ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは一本鎖のキメラＲＮＡに設計でき（前記
⑴ア），ヌクレオチド２３～４８を保持した長いキメラＡ（ｔｒａｃｒ配列のヌクレ
オチド長は２６）が，二本鎖のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体を用いた場合
と同じような挙動でＣａｓ９によるＤＮＡ切断を誘導したこと，他方，短いキメラ
Ｂ（ｔｒａｃｒ配列のヌクレオチド長は１８）の場合には，ＤＮＡ切断を誘導でき
なかったこと（前記⑴エ，オ，図５Ｂ）が示されている。
以上の引用例２の実験結果に接した本願優先日の当業者は，２６ヌクレオチド長
よりも短いｔｒａｃｒ配列は，Ｃａｓ９の開裂効果が劣ることから，Ｃａｓ９タン
パク質による標的配列の開裂には，少なくとも，天然配列の２３～４８を保持した
２６ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ配列を含む必要があることを理解する。
ところが，ｔｒａｃｒ配列の長さについては，２６ヌクレオチドより短い場合と
の比較では，長い２６ヌクレオチドの方が好ましいことは理解できるものの，引用
例２には，２６ヌクレオチドより長い場合で比較した場合に，より長さの大きいｔ
ｒａｃｒ配列の方が好ましいことを示す記載は，見当たらない。
加えて，本件全証拠によっても，本願優先日当時，ｔｒａｃｒ配列の長さが大き
ければ大きいほど好ましいことを示す技術常識が存在したことを認めるに足りない。
(イ) 一方，本願明細書の【０１６２】によると，ｔｒａｃｒ配列の長さとゲノム
改変効率の関係について，
「ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的
について，ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察
された」との一般的な説明がされ，本願明細書の図１６や図１７から，プロトスペ
ーサー１やプロトスペーサー３を標的とした場合に，ｔｒａｃｒ配列の長さが３２
のキメラＲＮＡの方が，ｔｒａｃｒ配列の長さが２６のキメラＲＮＡよりも，ゲノ
ム改変効率に優れていると理解することができる。
そうすると，引用例２の記載や本願優先日の技術常識を勘案しても，ゲノムの改
変効率を向上させる観点で，引用発明２のｔｒａｃｒＲＮＡの長さについて，引用
例２に具体的に開示されている２６から３０以上に変更することを，当業者が動機
付けられていたということはできない。
(ウ) また，本願優先日当時，引用例２の要約に記載された細菌や古細菌の獲得免
疫に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（前記⑴ア）を，緩衝液中での混合（試験管レ
ベル）でなく，真核細胞に適用することができた旨を報告する技術論文や特許文献
は存在しておらず，ｔｒａｃｒ配列の長さを３０以上に設定するという技術手段を
採用することで，真核細胞におけるゲノム改変効率が向上するという効果は，当業
者の期待や予測を超える効果と評価することができる。
(エ) したがって，相違点４として挙げた本願発明の発明特定事項，すなわち「ｔ
ｒａｃｒ配列」について，
「３０以上のヌクレオチドの長さ」とすることは，引用例
２の記載や本願優先日の技術常識を参酌しても，当業者が容易に想到し得たとはい
えないものである。
イ 被告の主張について
被告は，引用例２の記載から，２３～４８の２６ヌクレオチド長を含むｔｒａｃ
ｒＲＮＡであれば，その５’末端側や３’末端側にさらにヌクレオチドが存在して
も，Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断を誘導できると理解することができるとした上，引
用例２には５’末端側や３’末端側にヌクレオチドを付加してさらに長くすること
を妨げる記載はなく，図３Ａには，上記最小領域のほか，「１５－５３」「２３－
，
８９」「１５－８９」の領域からなるさらに長いｔｒａｃｒＲＮＡも，ｃｒＲＮＡ
，
と共に用いることでＣａｓ９によるＤＮＡ切断を誘導できることが示されていると
して，引用発明２のうち「ｔｒａｃｒＲＮＡ」を多少長くして３０ヌクレオチド長
程度のものとすることは，当業者が適宜なし得たことであると主張する。
しかし，図３Ａには，長いｔｒａｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡと組み合わせて二本鎖
として用いた実験結果が示されるものの，特に長いｔｒａｃｒＲＮＡの方が標的配
列の開裂に優れることは開示されていない。また，引用発明２のｔｒａｃｒ配列の
長さを２６から３０にするには，１５％以上長くする必要があるから，これが多少
長くした程度のものであるとはいえない。さらに，上記のとおり，本願優先日当
時，ｔｒａｃｒ配列の長さが大きければ大きいほど，好ましいことを示す技術常識
は存在せず，真核細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を適用したことを報告する技術論
文，特許文献も存在しなかったことからすれば，ｔｒａｃｒ配列の長さを３０以上
に設定することに伴い真核細胞におけるゲノム改変効率が向上するという効果は，
当業者の期待や予測を超えるものと評価されるというべきである。
そうすると，上記主張は採用することができない。
⑸ 小括
以上のとおり，本願発明と引用発明２との相違点４は容易に想到できるとはいえ
ないので，本願発明につき特許法２９条２項の規定により特許を受けることができ
ないとした本件審決の判断には誤りがある。
よって，取消事由２は理由がある。
４ 結論
以上によれば，原告らの主張する取消事由１及び２はいずれも理由がある。
よって，本件審決を取り消すこととし，主文のとおり判決する。
知的財産高等裁判所第１部
裁判長裁判官 高 部 眞 規 子
裁判官 小 林 康 彦
裁判官 関 根 澄 子
【図１７】
別紙２（引用発明１図面等目録）
【表７】
【表８】
【図４】
別紙３（引用発明２図面目録）
【図３】
【図５】
【図Ｓ１４】